無乳鏈球菌Sip蛋白的表達(dá)及免疫保護(hù)性研究.pdf

1、無乳鏈球菌(Sagalactiae)不僅能引起動(dòng)物乳房炎，還能引起人的多種感染。對(duì)這些感染過去人們一直采用抗生素治療，但由于抗生素具有許多副作用，并不斷導(dǎo)致無乳鏈球菌耐藥菌株產(chǎn)生，使抗生素治療無乳鏈球菌感染受到了限制。因而促使人們尋求新的防制無乳鏈球菌感染方法。研究證實(shí)，無乳鏈球菌Sip蛋白作為抗原免疫小鼠，能提供良好的免疫保護(hù)效果。但有關(guān)Sip蛋白對(duì)無乳鏈球菌引起的動(dòng)物乳房炎是否具有保護(hù)作用，尚不清楚。因此，本研究使用表達(dá)的Sip重組

2、蛋白制備抗原，免疫奶山羊后研究其對(duì)無乳鏈球菌性乳房炎的免疫保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究開發(fā)無乳鏈球菌基因工程疫苗提供參考。 本研究從患乳房炎的奶牛乳汁中分離到1株鏈狀球菌，并進(jìn)行培養(yǎng)特性、生化特性、致病性等鑒定和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果，該菌株在血瓊脂培養(yǎng)基上長成淡灰白色、隆起、閃光的小菌落，呈p溶血；在腦心浸出液(BHI)中培養(yǎng)，初期表現(xiàn)為均勻混濁，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，在管底出現(xiàn)沉淀；在6.5％NaCI的BHI中不生長；鏡檢為革蘭氏陽性球菌，呈

3、長鏈狀排列；山梨醇、甘露糖、七葉苷和棉實(shí)糖酵解試驗(yàn)陰性，乳糖、水楊苷和馬尿酸鈉酵解試驗(yàn)陽性；對(duì)試驗(yàn)所使用的青霉素G、復(fù)方新諾明、紅霉素等12種抗生素均不敏感；將該菌株經(jīng)乳房人工感染泌乳奶山羊，可引起乳房發(fā)生急性炎癥，產(chǎn)奶量下降，CMT檢測(cè)陽性甚至強(qiáng)陽性，乳汁SCC升高，乳汁成分發(fā)生變化，同時(shí)伴有體溫升高、心跳加快等全身癥狀。以上結(jié)果表明該菌株為致病性無乳鏈球菌。 按照GenBank中的sip基因序列，利用DNAStar軟件分析，

4、設(shè)計(jì)一對(duì)引物。從分離菌株中擴(kuò)增獲得sip基因。將sip基因插入到pET-32a(+)表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到Ecoli BL<,21>(DE3)，經(jīng)篩選獲得pET-sip重組菌，表達(dá)后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果，所擴(kuò)增的核酸序列與GenBank中提供的sip基因序列相比，核苷酸和氨基酸同源性均為98％。說明sip基因高度保守。進(jìn)一步對(duì)重組菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和SDS-PAGE分析。結(jié)果與對(duì)照菌株相比，誘導(dǎo)后的pET-sip表達(dá)約為71 kDa

5、、含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白。經(jīng)抗組氨酸標(biāo)簽抗體進(jìn)行westem-blotting分析證實(shí)，表達(dá)的融合蛋白為目的蛋白。 利用重組蛋白上6個(gè)組氨酸殘基能與Ni<'2+>結(jié)合的特性，用MagneHis<'TM>蛋白純化系統(tǒng)對(duì)Sip重組蛋白進(jìn)行純化，得到單一的目的蛋白。將純化后的Sip重組蛋白濃縮，并用弗氏佐劑乳化后，按3mg/羊的劑量皮下多點(diǎn)注射免疫5只奶山羊，并以等量生理鹽水免疫3只奶山羊作對(duì)照。間隔兩周再加強(qiáng)免疫1次。二免后兩

6、周，每只奶山羊一側(cè)乳頭管內(nèi)注射無乳鏈球菌2×10<'6>CFu，觀察7天。結(jié)果，未免疫組奶山羊全部發(fā)病，乳房出現(xiàn)紅、腫、熱、痛、觸之堅(jiān)實(shí)等癥狀，乳汁由乳白色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色，并出現(xiàn)漿液性液體，內(nèi)含少量凝乳塊；CMT檢測(cè)為強(qiáng)陽性；乳汁SCC升高，最高達(dá)630.7±72.5萬/mL；乳汁成分改變；乳汁細(xì)菌學(xué)檢查在接菌側(cè)乳汁中均檢出原接種細(xì)菌。而免疫組奶山羊均未見發(fā)病，兩側(cè)乳房均未出現(xiàn)上述變化，乳汁細(xì)菌學(xué)檢查兩側(cè)乳房乳汁中均未檢出原接種細(xì)菌，免疫