尼羅羅非魚無乳鏈球菌腦膜炎病理損傷的動態(tài)研究及無乳鏈球菌透明質(zhì)酸酶多克隆抗體制備.pdf

1、腦膜炎是羅非魚無乳鏈球菌病的特征性臨床癥狀，建立羅非魚無乳鏈球菌腦膜炎模型，并制定相應的臨床癥狀及組織病理學評分系統(tǒng)，對研究羅非魚無乳鏈球菌病的致病機制具有十分重要的意義。
　　1、無乳鏈球菌感染尼羅羅非魚的腦膜炎造模構(gòu)建:將健康羅非魚43尾，隨機分為4組:1個對照組(n=10)和3個實驗組(n=33)。其中，3組實驗組根據(jù)不同感染劑量分為:1.0×106cfu組(n=11)、1.0×107cfu組(n=11)、1.0×108cf

2、u組(n=11)。實驗組分別將1.0×107、1.0×108、1.0×109cfu/mL的無乳鏈球菌菌液腹腔注射尼羅羅非魚復制腦膜炎模型，0.1mL/尾;對照組相同劑量注射0.85％生理鹽水。對實驗組感染尼羅羅非魚連續(xù)觀察直至瀕死或死亡，記錄其臨床癥狀、剖檢病變、腦組織（端腦、中腦、小腦、延腦）病理學變化，并結(jié)合細菌學檢測，按照擬定的評分系統(tǒng)評價各組腦膜炎的造模效果，確定最佳造模方案。實驗結(jié)果顯示:1、大體病理學變化:各實驗攻毒組尼羅羅

3、非魚感染后2d均出現(xiàn)不同程度死亡，未見明顯神經(jīng)癥狀。感染后3d至以后的幾天魚體開始出現(xiàn)異?；顒拥纳窠?jīng)癥狀及突眼、角膜混濁等病理變化。2、組織病理學變化:感染尼羅羅非魚的腦部出現(xiàn)軟腦膜炎、腦膜腦炎等病理變化。蛛網(wǎng)膜下腔和腦軟膜上出現(xiàn)大量炎性滲出物和染成藍紫色微細顆粒的細菌團塊;腦膜充血、水腫、疏松、增厚，有大量的中性白細胞等炎性細胞浸潤;腦實質(zhì)部基質(zhì)疏松水腫，呈海綿狀;腦組織內(nèi)大量炎性細胞浸潤、膠質(zhì)細胞增生等。統(tǒng)計比較各組得分發(fā)現(xiàn):107

4、cfu組的無乳鏈球菌攻毒尼羅羅非魚造模效果最好:臨床癥狀顯著而組內(nèi)尼羅羅非魚差異性最小，組織病理學觀察患病尼羅羅非魚病情和緩適中、利于觀察研究，并可在攻毒后第3d成功構(gòu)建腦膜炎模型，造模率為100％。
　　2、尼羅羅非魚無乳鏈球菌腦膜炎病理損傷的動態(tài)研究:健康尼羅羅非魚152尾，實驗組80尾以最優(yōu)建模濃度的無乳鏈球菌(107cfu)攻毒尼羅羅非魚，腹腔注射無乳鏈球菌稀釋液0.5×108cfu/mL，每尾注射劑量為0.2mL;對照組

5、72尾，每尾腹腔注射0.2mL0.85％生理鹽水。分別于4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h、56h、60h、64h、68h、72h隨機剖殺實驗魚4尾和對照組4尾，觀察記錄尼羅羅非魚腦組織的大體病理學變化和組織病理學變化的動態(tài)變化過程。實驗結(jié)果表明:在腦膜炎出現(xiàn)的早期(4-20h)大體病變主要為腦組織顏色變紅，散在少量出血點;組織學可觀察到腦膜及腦組織血管充、出血。中期(24

6、-40h)，大體病變主要為腦組織腫脹，腦脊液呈凝膠狀;組織學可觀察到神經(jīng)細胞腫脹，間腦腦室出血少量絮狀物（即腦脊液性狀發(fā)生變化）。晚期((44-64h)，大體病變主要為出現(xiàn)膠凍樣腦脊液;組織學可觀察到蛛網(wǎng)膜下腔大量中性粒細胞浸潤。瀕死期(68h-72h)，大體病變主要為腦組織的軟化、萎縮，可見液化壞死灶;組織學可觀察到各部位腦基質(zhì)溶解、疏松，部分出現(xiàn)膿性壞死灶，各部位神經(jīng)纖維（特別是延腦神經(jīng)纖維）嚴重斷裂、溶解，并伴有血管反應，膠質(zhì)細胞

7、增生，嗜神經(jīng)現(xiàn)象等。40h蛛網(wǎng)膜下腔開始出現(xiàn)少量無乳鏈球菌，72h蛛網(wǎng)膜下腔可見大量無乳鏈球菌存在。按照腦組織各部位出現(xiàn)壞死的時間來看，無乳鏈球菌侵襲各部位的時間順序為:延腦(4h)——中腦(52h)——端腦(64h)——間腦(72h以后)——小腦(72h以后)。巨噬細胞在不同部位出現(xiàn)的先后順序為:端腦(24h)——間腦(32h)——腦膜(52h)——延腦(72h)。
　　3、無乳鏈球菌透明質(zhì)酸酶多克隆抗體的制備。根據(jù)GenBan

8、k中登錄的羅非魚源無乳鏈球菌GD201008-001(GenBank登錄號分別為CP003810.1)基因組序列針對hylB基因設計引物，對無乳鏈球菌透明質(zhì)酸酶hylB基因進行克隆，成功獲得重組質(zhì)粒pMD19-T-hylB。將含粘性末端的目的序列與表達質(zhì)粒pET32a(+)連接獲得pET-32a(+)-hylB，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入表達載體BL21(DE3)，成功構(gòu)建表達質(zhì)粒BL21-pET-32a(+)-hylB，原核表達目的蛋白。結(jié)果表明，

9、37℃誘導表達4h，IPTG濃度為0.1 mmol/L，無乳鏈球菌透明質(zhì)酸酶重組蛋白大小為98.89KDa。鑒于表達質(zhì)粒中的組氨酸與咪唑具有高親和力，選擇親和層析的方法純化目的蛋白，之后梯度尿素復性。將制備的純化蛋白免疫兩只健康家兔，兔抗透明質(zhì)酸酶血清經(jīng)瓊脂擴散實驗檢測，重組透明質(zhì)酸酶具有良好的免疫原性，制備的抗體效價為1∶16。本實驗獲得的兔抗透明質(zhì)酸酶血清可以用于后續(xù)免疫組化研究透明質(zhì)酸酶在無乳鏈球菌動態(tài)侵襲羅非魚過程中的作用，結(jié)合