魚源無乳鏈球菌透明質(zhì)酸酶和金屬蛋白酶基因缺失株構(gòu)建及特性分析.pdf

1、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），又稱B族鏈球菌(group B streptococci，GBS)，是一種重要的人-獸-魚共患的病原菌。近年來，魚源無乳鏈球菌導(dǎo)致大規(guī)模羅非魚死亡，嚴(yán)重影響了我國羅非魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，魚源無乳鏈球菌比其他水生環(huán)境的病原菌具有更強(qiáng)的傳染性，并且對(duì)魚類可達(dá)到100％的致死率。因此，對(duì)無乳鏈球菌致病性及致病機(jī)理的研究對(duì)于防控魚類鏈球菌病至關(guān)重

2、要。
　　1魚源無乳鏈球菌透明質(zhì)酸酶hylB基因的克隆表達(dá)及抗原性分析
　　透明質(zhì)酸酶(HylB)是無乳鏈球菌分泌的蛋白水解酶，是該菌重要的毒力因子。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室分離并公布在GenBank上的羅非魚源無乳鏈球菌全基因組序列，PCR擴(kuò)增獲得長為2346bp，覆蓋保守功能區(qū)的hylB基因片段。將該片段采用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ消化后亞克隆至表達(dá)載體pET28a(+)，經(jīng)雙酶切、測序鑒定后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中

3、，進(jìn)行體外原核表達(dá)，獲得88.5ku的目的蛋白。將純化后的目的蛋白免疫家兔制備多克隆抗體，經(jīng)ELISA和Western blot鑒定該蛋白具有良好的免疫原性。
　　2魚源無乳鏈球菌hylB及mp基因缺失株的構(gòu)建
　　根據(jù)魚源無乳鏈球菌GD201008-001株的基因組，分別設(shè)計(jì)hylB和mp基因上下游引物，擴(kuò)增目的基因上下游片段，通過融合PCR方法融合擴(kuò)增上下游同源臂。將上下游同源臂連接至鏈球菌-大腸桿菌溫度敏感型自殺質(zhì)粒p

4、SET-4s。通過電擊轉(zhuǎn)化將自殺性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GD201008-001株進(jìn)行同源重組，通過抗性篩選出雙交換后的hylB基因和mp基因缺失株，并進(jìn)行常規(guī)PCR及熒光定量PCR鑒定。將含有啟動(dòng)子的目的基因片段連入pSET-2穿梭質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入缺失株，PCR檢測基因?yàn)殛栃缘募礊榛パa(bǔ)株。試驗(yàn)成功構(gòu)建了hylB基因和mp基因的缺失株及互補(bǔ)株，為進(jìn)一步的生物學(xué)特性分析奠定了基礎(chǔ)。
　　3魚源無乳鏈球菌hylB和mp基因缺失株的特性分析
　　為

5、進(jìn)一步研究無乳鏈球菌GD201008-001株HylB和Mp蛋白的功能，試驗(yàn)比較了hylB和mp基因的缺失株、互補(bǔ)株和野生株在生物體內(nèi)外的特性差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hylB及mp基因缺失株、互補(bǔ)株和野生株生長曲線均無明顯差異。mp基因缺失株對(duì)斑馬魚的LD50上升，在小鼠血液和腦部定殖數(shù)下降;在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力隨著時(shí)間變化呈下降趨勢;缺失株培養(yǎng)上清對(duì)Bend.3細(xì)胞毒性下降明顯。以上研究結(jié)果揭示Mp蛋白是無乳鏈球菌重要的毒力因子，在無乳鏈球

6、菌抵制宿主巨噬細(xì)胞吞噬并存活的過程中發(fā)揮重要作用。hylB基因缺失株的生物學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，與野生株和互補(bǔ)株相比，缺失株不能利用透明質(zhì)酸為細(xì)菌生長提供碳源，對(duì)斑馬魚的LD50上升明顯，在小鼠血液、脾臟和腦部定殖數(shù)下降，在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力隨著時(shí)間變化下降明顯，且感染小鼠脾臟及巨噬細(xì)胞引起促炎因子表達(dá)能力顯著升高，對(duì)Bend.3細(xì)胞的毒性及黏附能力下降。研究結(jié)果表明無乳鏈球菌HylB蛋白有助于細(xì)菌在動(dòng)物及巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活，同時(shí)影響巨噬細(xì)胞