致仔豬腦膜炎新型豬鏈球菌的鑒定.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，S.suis）導(dǎo)致患病豬的腦膜炎，敗血癥以及各種化膿性炎癥，是引起公共衛(wèi)生危害的重要病原之一。按照莢膜抗原的血清學(xué)分類(lèi)，目前共有35個(gè)豬鏈球菌的血清型。此外還存在不能定型或者不屬于現(xiàn)有血清型的菌株。
　　1. 仔豬腦膜炎新型豬鏈球菌分離株的鑒定和毒力分析
　　2013年3月至5月，江蘇某豬場(chǎng)大量斷奶仔豬患病死亡。發(fā)病率達(dá)35％，死亡率為90％。患病動(dòng)物表現(xiàn)出共濟(jì)失調(diào)、轉(zhuǎn)圈、頭部

2、震顫等明顯的腦膜炎癥狀。剖檢9只瀕臨死亡的病豬發(fā)現(xiàn)，腦部均有不同程度的水腫和點(diǎn)狀出血。從仔豬腦組織中分離培養(yǎng)獲得一株細(xì)菌，命名為CZ130302。通過(guò)生化鑒定，結(jié)合16S rRNA基因和谷氨酸脫氫酶基因(gdh)的測(cè)序鑒定，確定該細(xì)菌(CZ130302)為豬鏈球菌。電鏡觀察CZ130302株有莢膜結(jié)構(gòu)，與參考血清的凝集試驗(yàn)和多重PCR分型鑒定方法進(jìn)一步確定該分離株不屬于現(xiàn)有的任一血清型。制備豬鏈球菌CZ130302菌株的高免血清。該血清

3、與現(xiàn)有的35個(gè)血清型菌株進(jìn)行凝集反應(yīng)試驗(yàn)，結(jié)果均為陰性。150只BALB/c小鼠隨機(jī)分為15組，測(cè)定CZ130302的半數(shù)致死量(LD50)為2.89×106 CFU/只。對(duì)照豬鏈球菌2型毒力株P(guān)1/7的致死率為1/10，HA9801的致死率為2/10。攻毒試驗(yàn)接種2×107CFU/只，結(jié)果顯示CZ130302的致死率為8/10，感染小鼠出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)，轉(zhuǎn)圈以及抽搐，小鼠剖檢癥狀與病豬的癥狀吻合，剖檢取病鼠的腦組織制作組織切片，發(fā)現(xiàn)腦部細(xì)

4、胞出現(xiàn)典型的細(xì)菌性腦膜炎的病理特征，表現(xiàn)為大量中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，膠質(zhì)細(xì)胞噬神經(jīng)原現(xiàn)象以及大量神經(jīng)細(xì)胞的固縮和液化。人喉癌上皮（HEp-2）細(xì)胞粘附試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CZ130302的定植力與強(qiáng)毒株HA9801定植力相當(dāng)，低于歐洲經(jīng)典毒力株(1×107 CFU/well);小鼠腦內(nèi)皮(bEnd.3)細(xì)胞的粘附試驗(yàn)中，CZ130302菌株則與HA9801和P1/7相一致(p＜0.01)。對(duì)CZ130302的毒力因子檢測(cè)結(jié)果表明該新型菌株的毒力基因型為

5、gdh+/orf2+/purD+/gene+/DltA+/PgdA+/Sortase A+/SspA+，不同于HA9801的毒力表型特征mrp+/epf+/sly+。
　　2. CZ130302株莢膜合成相關(guān)基因分析及PCR定型方法的建立
　　CZ130302菌株全基因組測(cè)序并補(bǔ)洞和拼接，結(jié)果證實(shí)該菌株在進(jìn)化樹(shù)中處于獨(dú)立的分支中，既不屬于29個(gè)豬鏈球菌血清型分支，也不屬于建議被排除在豬鏈球菌以外的32、34以及20、22、2

6、6、33血清型。
　　通過(guò)莢膜合成相關(guān)基因序列的比對(duì)和分析發(fā)現(xiàn)，CZ130302株完整的莢膜基因組與現(xiàn)公布的豬鏈球菌不同血清型的莢膜基因組結(jié)構(gòu)相似，莢膜合成途徑依賴于Wzy/wzx的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。CZ130302菌株的莢膜基因組的開(kāi)放閱讀框(orf)和蛋白質(zhì)同源組(HGs)的注釋和命名暫定為“Chz”的注釋和命名，Chz-A至Chz-G的序列同源性較高，都在90％以上，在其他血清型的CPS比對(duì)中也較為統(tǒng)一;Chz-G至Chz-J區(qū)間差

7、異性較大，一般都在50％左右;Chz-J至Chz-P具有典型的型特異性。共發(fā)現(xiàn)23個(gè)HGs和4個(gè)未知的HGs，包括多糖合成酶(Wzy Polysaccharide polymerase)基因、翻轉(zhuǎn)酶（Wzx flippase）基因、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferase)基因以及乙?；D(zhuǎn)移酶(acetyltransferase)基因等莢膜代謝途徑看家基因。與現(xiàn)有的豬鏈球菌血清型進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，CZ130302菌株的以上4個(gè)

8、看家基因處在獨(dú)立的分支中，與豬鏈球菌的其他血清型的進(jìn)化關(guān)系相似。
　　選擇Wzy/wzx的看家基因，作為PCR定型的基因設(shè)計(jì)Chz-M和Chz-O擴(kuò)增引物，在已經(jīng)建立的多重PCR分型體系中與參考血清型的菌株反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Chz-M基因引物與其他參考株無(wú)交叉反應(yīng)。凝集試驗(yàn)和Chz-M定型引物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室保存的64株未能定型臨床分離株，篩選出三株該血清型的臨床分離株，分別為AH681(安徽，2006)，HN136（河南，2007），CZ11

9、09（江蘇，2011），血清凝集試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)AH681株反應(yīng)結(jié)果為陰性，其余兩株為陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果。電鏡檢測(cè)AH681菌株無(wú)莢膜結(jié)構(gòu)。測(cè)定CZ130302、AH681、HN136新型細(xì)菌的半數(shù)致死量(LD50)，結(jié)果顯示CZ1109的LD50為2.433×106 CFU/只，接近于CZ130302的半數(shù)致死量。而AH681和HN136無(wú)法檢測(cè)出LD50。
　　對(duì)豬鏈球菌的7個(gè)看家基因(dpr、mutS、cpn60、thrA、recA、

10、aroA、gki) PCR擴(kuò)增后測(cè)序，建立多位點(diǎn)序列分型(MLST)圖譜，結(jié)果顯示CZ130302以及CZ110902屬于ST-383型，不屬于臨床分離的敗血癥致病株ST-1型。無(wú)莢膜的菌株AH681屬于ST-475型，也不屬于其他的ST型;HN136屬于ST-264型。
　　綜上，從罹患腦膜炎的仔豬腦組織中分離得到豬鏈球菌CZ130302，感染BALB/c小鼠后復(fù)制出相同的腦膜炎癥狀，為一株新血清型的豬鏈球菌。該菌株的莢膜多糖基