尼羅羅非魚Ikaros基因克隆、組織表達(dá)及抗無乳鏈球菌相關(guān)SNP位點(diǎn)篩選.pdf

1、羅非魚是世界上最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，具有生長快、繁殖力高、適應(yīng)性強(qiáng)和食性廣等優(yōu)點(diǎn)，已在世界各地進(jìn)行了廣泛引種與養(yǎng)殖。但是自2009年以來，羅非魚鏈球菌病在羅非魚養(yǎng)殖中大規(guī)模暴發(fā)且頻繁發(fā)生與流行，給羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。培育羅非魚抗病品系是解決羅非魚鏈球菌病害的重要途徑之一。分子標(biāo)記輔助育種是一種高效的育種方法，利用分子標(biāo)記可以定向選育羅非魚抗病品系，增加選育強(qiáng)度從而加速其遺傳改良進(jìn)程。單核苷酸多態(tài)性（single nu

2、cleotide polymorphism,SNP）因具有標(biāo)記數(shù)量多且易于檢測等特點(diǎn)成為MAS中最為常用的分子標(biāo)記。Ikaros是一種C2H2型鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子，對淋巴細(xì)胞的正確發(fā)育及其免疫功能的正常發(fā)揮具有重要作用，但其在羅非魚中的研究還未見相關(guān)報(bào)道。因此，開展尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）免疫相關(guān)候選基因Ikaros基因的相關(guān)功能研究，并從中篩選抗病相關(guān)SNP分子標(biāo)記，這可為實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助羅非魚抗病選育

3、奠定基礎(chǔ)。
　　本研究對尼羅羅非魚Ikaros基因的cDNA序列和基因組DNA序列進(jìn)行了克隆，對基因的結(jié)構(gòu)特征、組織分布及其對無乳鏈球菌感染的響應(yīng)進(jìn)行分析，初步了解Ikaros基因的生物學(xué)功能；對Ikaros基因5’調(diào)控區(qū)序列中的SNPs進(jìn)行檢測，并與無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）抗性進(jìn)行相關(guān)性分析，以期獲得抗病相關(guān)的SNPs，為尼羅羅非魚遺傳育種研究提供新的分子標(biāo)記，研究結(jié)果具體如下：
　　

4、1.尼羅羅非魚Ikaros基因的克隆與組織表達(dá)
　　本試驗(yàn)采用RT-PCR和RACE等方法克隆了尼羅羅非魚Ikaros基因的cDNA序列以及利用PCR和染色體步移技術(shù)克隆了Ikaros的基因組DNA序列。對Ikaros基因序列分析發(fā)現(xiàn)，Ikaros基因組DNA為20454 bp，包括7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子，經(jīng)可變剪接可形成6種不同的mRNA剪接異構(gòu)體，其編碼的氨基酸序列均具有Ikaros家族典型的鋅指結(jié)構(gòu)域且與硬骨魚類Ikaros

5、氨基酸序列同源性較高（70.6％~93.7%）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了Ikaros mRNA在尼羅羅非魚中的組織分布及其對無乳鏈球菌感染的響應(yīng)。結(jié)果顯示，Ikaros基因在健康尼羅羅非魚11種被檢測的組織或器官中均有表達(dá)，其中在血液中的表達(dá)量最高，其次為胸腺、脾臟和頭腎。人工感染無乳鏈球菌后，血液、胸腺、脾臟、頭腎中Ikaros基因的相對表達(dá)量均顯著上調(diào)，并在48h達(dá)到峰值，這表明Ikaros基因參與調(diào)控尼羅羅非魚抵御無乳鏈球菌的

6、免疫應(yīng)答反應(yīng)。
　　2.尼羅羅非魚Ikaros基因5’調(diào)控區(qū)序列的克隆與分析
　　通過染色體步移法從尼羅羅非魚的基因組中克隆獲得Ikaros基因5’調(diào)控區(qū)序列，長度為4178 bp。使用在線生物信息學(xué)軟件對Ikaros基因5’調(diào)控區(qū)序列進(jìn)行預(yù)測與分析，預(yù)測尼羅羅非魚Ikaros基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)位于起始密碼子（ATG）上游931 bp位置，核心啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-57 bp~48 bp的區(qū)間；預(yù)測的Ikaros基因啟動(dòng)子

7、區(qū)域具有真核生物啟動(dòng)子基本結(jié)構(gòu)元件：TATA框、CCAAT框、八聚體元件等。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測顯示，在Ikaros基因5’調(diào)控區(qū)-2200 bp~1200 bp的序列中存在豐富的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包含GATA-1、Homeobox、CDP CR3+HD、AP-1等。CpG島分析顯示Ikaros基因具有2個(gè)CpG島，分別位于啟動(dòng)子和第一外顯子上。
　　3.尼羅羅非魚Ikaros基因5’調(diào)控區(qū)序列的SNPs及其與無乳鏈球菌抗性的關(guān)聯(lián)

8、分析
　　采用直接測序法在親本（F0）尼羅羅非魚的Ikaros基因5?調(diào)控區(qū)序列中篩查到5個(gè)SNPs，分別將其命名為SNP1（g.562,G＞A）、SNP2（g.217,G＞T）、SNP3（g.-53,C＞T）、SNP4（g.-220,T＞C）和SNP5（g.-579,T＞C）。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)這些SNPs均分布在啟動(dòng)子的各種調(diào)控元件中，可能會(huì)對 Ikaros基因的精確表達(dá)產(chǎn)生重要影響。通過Snapshot方法對5個(gè)SNPs在子一代（F

9、1）尼羅羅非魚易感群體和抗病群體中進(jìn)行基因分型及與無乳鏈球菌抗性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNP2（g.217,G＞T）、SNP3（g.-53,C＞T）、SNP4（g.-220,T＞C）和SNP5（g.-579,T＞C）的基因型頻率和等位基因頻率在易感群體和抗病群體中存在顯著差異（P＜0.05），表明這4個(gè)SNPs與無乳鏈球菌抗性顯著相關(guān)。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)SNPs可形成一個(gè)單倍塊和5種單倍型，其中GGCTT單倍型與抗病性顯著相關(guān)（