廣西羅非魚無乳鏈球菌病病原分離、鑒定及毒力基因檢測分析.pdf

1、無乳鏈球菌已成為近年來羅非魚細(xì)菌性疾病中重要的致病菌,給羅非魚產(chǎn)業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前引起羅非魚鏈球菌病的致病菌主要有海豚鏈球菌和無乳鏈球菌。本研究對(duì)廣西8個(gè)市12個(gè)縣/區(qū)采集的672個(gè)羅非魚病樣進(jìn)行細(xì)菌分離,并通過API20 Strep試劑條及16S rRNA分子鑒定,從其中30個(gè)病樣中共分離到無乳鏈球菌30株,其中南寧市7株、欽州市3株、北海市7株、柳州市5株、梧州市1株、玉林市7株。無乳鏈球菌的總檢出率為4.46％。在檢出的

2、30株無乳鏈球菌中,有9株溶血試驗(yàn)呈陰性,其余21株的溶血試驗(yàn)呈陽性。利用 BLAST分析了30株試驗(yàn)菌株的16S rRNA基因序列和與 GenBank中已登錄鏈球菌相應(yīng)序列的同源性,結(jié)果顯示,30株試驗(yàn)菌株與無乳鏈球菌(S.agalactiae)海南分離株JF423947、廣東分離株JQ039375、KF111315及廣西分離株JQ990156的相應(yīng)序列高度同源(98.5%~100%),與海豚鏈球菌(S.iniae)中的EU62251

3、4株、FJ870987株,停乳鏈球菌(S.dysgalactiae)中的AB159678株、X59030株,化膿性鏈球菌(S.pyogenes)中的AB023575株、EU660335的相應(yīng)序列的同源性相對(duì)較低,分別為93.4%~95.8%、88.9%~96.4%、95.3%~96.1%。30株廣西分離株之間高度同源,為99.1%~100%。
　　對(duì)羅非魚的人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示,30株菌株均為致病性菌株,但其毒力在不同菌株間均存在

4、一定差異,GXYL2G、XYL4、GXYL6、GXYL74株菌株的致死率均為100%,致病力最強(qiáng);GXNN2、GXBH1、GXBH3、GXBH4、GXBH55株菌株的致死率均低于80%,其余21株菌株的致死率在80.0%~97.5%之間。28種藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,30株無乳鏈球菌對(duì)氨芐青霉素、菌必治、先鋒必、鹽酸沙拉沙星、舒普深,先鋒 VI、多西環(huán)素7種抗生素的敏感率均在70%以上,最高可達(dá)100%,對(duì)磺胺類藥物磺胺二甲嘧啶、磺胺-

5、6-甲氧嘧啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶,復(fù)方磺胺嘧啶,以及慶大霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明、依諾沙星和新霉素等9種藥物的耐藥率均在80%以上。
　　采用PCR方法對(duì)30株無乳鏈球菌的cfb、cpsE和sip3種毒力基因進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,30株菌株為同一基因型cfb+cpsE+sip+。在30株無乳鏈球菌中,根據(jù)來源地,選取具有代表性的6株對(duì)其cfb、cpsE和sip基因進(jìn)行了克隆和測序分析,結(jié)果顯示,無乳鏈球菌廣西分離株 cfb、cpsE、s

6、ip基因核苷酸的同源性分別在99.1%~100%、99.6%~100%和99.5%~100%,氨基酸的同源性分別在98.8%~99.6%、100%、99.1%~100%之間?；趶V西分離株的3個(gè)毒力基因遺傳進(jìn)化樹分析,無乳鏈球菌廣西分離株的3個(gè)毒力基因各聚在同一個(gè)群內(nèi),與國內(nèi)各基因相應(yīng)參考菌株JQ289564(廣東)、HQ148672(廣東)、HQ148671(廣東)、JQ289567(海南)、HQ888682(海南)、EF694027