魚源無乳鏈球菌感染小鼠巨噬細胞差異轉(zhuǎn)錄基因的篩選及功能研究.pdf

1、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），亦稱B群鏈球菌(Group B Streptococcus，GBS)，具有廣泛的宿主感染范圍，可引起新生兒敗血癥、肺炎和腦膜炎，奶牛乳腺炎及魚類腦膜炎。近年來，無乳鏈球菌對魚類危害嚴重，已引起廣泛重視，但其致病機制尚不明確。本研究在比較魚源、牛源、人源無乳鏈球菌毒力的基礎(chǔ)上，利用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列(SCOTS)技術(shù)篩選了魚源無乳鏈球菌感染小鼠巨噬細胞差異轉(zhuǎn)錄的基因，并對其中

2、轉(zhuǎn)錄上調(diào)的aroA、dlpE、msrB及pulA等基因的功能進行了鑒定，對aroA缺失株作為弱毒疫苗免疫小鼠的保護效果進行了探討，研究結(jié)果為闡明無乳鏈球菌的致病機制提供了理論基礎(chǔ)，同時也具有潛在的應(yīng)用前景。
　　1.無乳鏈球菌與巨噬細胞和腦微血管內(nèi)皮細胞的相互作用
　　以小鼠巨噬細胞RAW264.7和腦微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3為體外研究模型，探討魚源無乳鏈球菌GD201008-001與細胞的互作。結(jié)果顯示，無乳鏈球菌可以被

3、巨噬細胞吞噬，吞噬數(shù)量與細菌濃度呈正相關(guān)。通過比較魚源、牛源、人源三株無乳鏈球菌的抗吞噬能力、巨噬細胞內(nèi)存活能力及對RAW264.7和bEnd.3的毒性發(fā)現(xiàn):魚源株GD201008-001的抗吞噬能力顯著高于牛源和人源株(P＜0.05），吞噬率分別為12.77％、28.48％和32.58％;3株無乳鏈球菌均可在巨噬細胞內(nèi)存活超過24h，在感染巨噬細胞24h時的存活率分別為16.18％、6.00％和94.87％; GD201008-001

4、對RAW264.7和bEnd.3的毒性水平也顯著高于牛源和人源株(P＜0.05)。說明魚源株GD201008-001的毒力強于牛源株和人源株。
　　2.SCOTS篩選魚源無乳鏈球菌感染小鼠巨噬細胞差異轉(zhuǎn)錄基因
　　利用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列(SCOTS)的方法，研究無乳鏈球菌在巨噬細胞內(nèi)存活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果共篩選到60個基因，分為7大類:9個基因與細菌細胞壁和外膜的合成相關(guān)，主要參與肽聚糖和外膜蛋白的合成;32個基因與代

5、謝和應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，參與糖類、脂類、蛋白質(zhì)及核酸的代謝;5個基因與細胞分裂和核酸的損傷修復(fù)相關(guān);4個基因與轉(zhuǎn)運功能相關(guān)，包括ABC轉(zhuǎn)運子和氯離子通道蛋白;4個基因與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)相關(guān);2個基因與蛋白分選相關(guān)，包括分子伴侶和信號肽;4個基因功能未知。其中，50％以上的上調(diào)基因參與了代謝和適應(yīng)反應(yīng)，部分基因在其它細菌的研究中已被證明與毒力相關(guān)。該試驗結(jié)果為揭示無乳鏈球菌在巨噬細胞內(nèi)存活及其感染的分子機制奠定了基礎(chǔ)。
　　3.差異轉(zhuǎn)錄基因缺失株

6、和互補株的構(gòu)建
　　針對SCOTS技術(shù)篩選到的GD201008-001在巨噬細胞中存活上調(diào)表達的aroA、clpE、msrB和pulA基因，為探討其功能，采用同源重組技術(shù)，利用溫敏型鏈球菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pSET4s和pSET2質(zhì)粒，分別構(gòu)建了4種基因的缺失株和相應(yīng)的互補株。經(jīng)過PCR鑒定、基因測序和實時定量PCR在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的檢測，證明缺失株與互補株構(gòu)建成功，遺傳穩(wěn)定性良好。與野生株GD201008-001相比，各缺失

7、株與互補株在細菌形態(tài)染色上無明顯差異，ΔpulA生長速度明顯低于野生株，其它各菌株的生長速度與野生株無明顯差異。
　　4.無乳鏈球菌感染小鼠巨噬細胞差異轉(zhuǎn)錄基因缺失株的生物學(xué)特性分析
　　對aroA、clpE、msrB、pulA基因缺失株，開展了巨噬細胞吞噬及胞內(nèi)存活能力，對酸性及氧化應(yīng)激環(huán)境的耐受能力，對小鼠微腦血管內(nèi)皮細胞的黏附能力，對小鼠巨噬細胞和腦微血管內(nèi)皮細胞的毒性作用，對斑馬魚及小鼠半數(shù)致死量，小鼠組織細菌載量，

8、以及巨噬細胞和小鼠早期促炎細胞因子表達能力的分析。結(jié)果表明，clpE缺失株被巨噬細胞吞噬的效率顯著升高。aroA、clpE、msrB基因缺失株在巨噬細胞中的存活能力有不同程度的降低，并且對體外模擬的氧化環(huán)境的耐受能力顯著降低。clpE、msrB基因缺失株對酸性環(huán)境的耐受能力也顯著降低。aroA、clpE、pulA基因缺失株對小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的黏附能力顯著降低，對巨噬細胞和腦微血管內(nèi)皮細胞的毒性作用也顯著下降。在動物感染試驗中，aro

9、A基因缺失株對斑馬魚和小鼠的LD50顯著提高，與野生株相比，分別增加了1.84×103和1.56×106倍。clpE、msrB、pulA基因缺失株對斑馬魚LD50有所升高，對小鼠的LD50無明顯變化，但是小鼠的死亡時間有所滯后。aroA、clpE、pulA基因缺失之后，缺失株在小鼠感染后16h時，小鼠血液、脾臟和腦的細菌載量顯著降低，而msrB基因缺失株僅在小鼠腦組織的載量顯著下降。此外，aroA基因缺失株感染巨噬細胞后，引起巨噬細胞早

10、期促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平上調(diào)倍數(shù)顯著高于野生株，而其它基因缺失株這三個細胞因子的轉(zhuǎn)錄水平則與野生株相當。在體內(nèi)試驗中，aroA基因缺失株感染小鼠后16h內(nèi)，IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA轉(zhuǎn)錄一直處于較低水平且無明顯變化，而野生株感染小鼠，這三個細胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄呈持續(xù)增長的趨勢，且在感染后期顯著高于aroA基因缺失株。
　　5.無乳鏈球菌aroA缺失株小鼠免疫效果評價
　　以

11、無乳鏈球菌aroA基因缺失株作為弱毒苗，并與全菌滅活苗相比，對小鼠的免疫效果進行評價。研究發(fā)現(xiàn)，單次免疫101～103CFU缺失株對小鼠均具一定的的免疫保護效果。當缺失株免疫劑量為103CFU/只時，免疫小鼠對104CFU(＞1000 LD50)野生株攻毒的相對保護率為90％。弱毒苗及滅活苗免疫組小鼠均會產(chǎn)生高水平的IgG抗體，且弱毒苗免疫組抗體水平高于滅活苗免疫組。同樣，兩種疫苗均可引起小鼠脾臟淋巴細胞CD4+和CD8+細胞的比率升高