豬鏈球菌毒力因子與免疫原性蛋白的篩選及斑馬魚模型轉(zhuǎn)錄組研究.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis）是豬的重要致病菌，在全世界廣泛分布，可以引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關節(jié)炎及急性死亡，也可導致生豬從業(yè)人員感染和死亡。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，豬鏈球菌分為35個血清型（1-34型，1/2型），其中豬鏈球菌2型(SS2)流行最廣，從發(fā)病動物中分離率最高。此外，豬鏈球菌9型(SS9)也是一個重要致病血清型，與斷奶仔豬的敗血癥、腦膜炎和肺炎的爆發(fā)有關，在澳大利亞、荷蘭、比利時、德國等國家SS9流

2、行較廣。流行病學調(diào)查表明，在中國SS9也經(jīng)常從病豬中分離到，并逐步呈上升趨勢。目前，豬鏈球菌毒力因子及免疫原性蛋白的研究大都限于SS2，SS9的相關研究很少。本研究應用蛋白質(zhì)組學方法篩選SS9毒力因子、SS9免疫原性蛋白、SS2與SS9共同抗原及基因芯片方法對豬鏈球菌斑馬魚模型的驗證。
　　 1 SS9分泌蛋白比較蛋白組學研究
　　 應用比較蛋白組學方法，從兩株不同毒力的SS9菌株分泌蛋白中檢測致病性差異相關蛋白，以期發(fā)

3、現(xiàn)SS9新的候選毒力因子。SS9菌株GZ0565與SH040917分別分離自病豬與健康豬。用斑馬魚模型評價兩株細菌毒力，GZ0565對斑馬魚半數(shù)致死量為3.8×105cfu/魚，而SH040917對斑馬魚不致病。同時，這兩株細菌在豬鏈球菌已知毒力因子分布方面也存在差異。將病豬分離株GZ0565中有而健康豬分離株SH040917中沒有的差異分泌蛋白經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS),或MALDI-TOF-TOF

4、-MS鑒定，分屬于13種蛋白。其中5種蛋白報道與毒力相關(DNA核酸酶、O-乙酰絲氨酸裂解酶、含LysM結(jié)構(gòu)的肽聚糖結(jié)合蛋白、磷酸甘油酸變位酶、5’－核苷酸酶），再用Southern雜交從基因水平驗證，其中4種候選毒力因子對應基因在健康豬分離株SH040917中沒有，這些蛋白的發(fā)現(xiàn)有助于進一步了解SS9的致病機制。
　　 2 SS9表面蛋白免疫蛋白組學研究
　　 利用免疫蛋白組學方法，以SPF小鼠抗SS9免疫血清作為一抗

5、，與通過二維凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上的SS9菌株GZ0565細胞壁蛋白雜交，從中鑒定12個免疫反應性蛋白斑點。從凝膠中切割相應的蛋白斑點，經(jīng)MALDI-TOF-MS或MALDI-TOF-TOF-MS鑒定，屬于8種免疫原性蛋白。它們分別是：精氨酸脫亞氨酸酶、胞外溶解物結(jié)合蛋白、延長因子TS、腦啡肽、多肽ABC運載體多肽結(jié)合蛋白、丙酮酸激酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、果糖二磷酸醛縮酶。上述免疫原性蛋白對應基因在SS9菌株中較保守，可作為SS9亞單位疫苗的

6、候選成分。
　　 3應用免疫蛋白組學方法篩選SS2與SS9共同抗原
　　 SS2及SS9都可致豬鏈球菌病。研制共同疫苗是防控由SS2與SS9引起豬鏈球菌病的有效手段。采用免疫蛋白組學的方法，鑒定SS2與SS9共同抗原，為研制共同疫苗提供理論基礎。分別以SPF小鼠抗SS2免疫血清、SS9免疫血清及免疫前對照血清作為一抗，與通過二維凝膠轉(zhuǎn)印到PVDF膜上的SS2菌株HA9801細胞壁蛋白雜交，通過比較免疫轉(zhuǎn)印蛋白圖譜的差異，

7、從中鑒定7個共同免疫反應性蛋白斑點。從二維凝膠中切割相應的蛋白斑點，經(jīng)MALDI-TOF-MS分析鑒定，分屬于4種蛋白：精氨酸脫亞氨酸酶、延長因子TS、O-乙酰絲氨酸裂解酶和1－磷酸果糖激酶。從SS9菌株GZ0565中克隆表達這4種蛋白，用SPF微型豬SS2康復血清通過免疫轉(zhuǎn)印方法進一步驗證其免疫原性。上述免疫原性蛋白對應基因在SS2和SS9菌株中相當保守，可作為SS2和SS9疫苗的候選成分。
　　 4斑馬魚感染豬鏈球菌后轉(zhuǎn)錄水

8、平的變化
　　 豬鏈球菌是豬的重要致病菌，然而，用普通豬判定細菌的毒力問題較多，結(jié)果不確定，阻礙了豬鏈球菌致病機理的研究。與豬相比，斑馬魚價廉易得、體型小、操作方便，特別適合于突變庫中突變株毒力的判定。本實驗室已經(jīng)成功地將斑馬魚作為豬鏈球菌的感染模型，并且被國際獸疫局所引用。應用Affymetrix斑馬魚芯片研究斑馬魚感染SS2菌株HA9801后基因表達的變化。在總共有14900轉(zhuǎn)錄本的芯片中，有189個基因發(fā)生變化，其中125

9、個基因上調(diào)表達，64個基因下調(diào)表達。在上調(diào)的基因中，若干基因的功能與免疫和炎癥反應、凝血過程、補體激活及急性階段反應及應激或防御反應有關，研究表明其中有三個基因（編碼血清淀粉樣蛋白A、基質(zhì)金屬蛋白酶9和凋亡相關半胱氨酸蛋白酶）在其它物種中與豬鏈球菌感染后的反應相同。下調(diào)基因有肌肉特異基因和與運動或行為的正調(diào)控有關的基因。挑選12個基因應用實時定量PCR對芯片數(shù)據(jù)進行驗證，結(jié)果與芯片的數(shù)據(jù)吻合。上述發(fā)現(xiàn)有助于用斑馬魚模型進一步探索豬鏈球菌