豬鏈球菌2型MRP與EPF部分片段串聯(lián)表達(dá)與免疫原性及檢測兩種豬源鏈球菌抗體間接ELISA方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、　　馬鏈球菌獸疫亞種(SEZ)和豬鏈球菌2型(SS2)是我國豬鏈球菌病的兩種主要病原。SEZ主要引起豬的化膿性關(guān)節(jié)炎和敗血癥，而SS2不僅可引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡，還可以感染相關(guān)人員并致死，是一種重要的人畜共患病病原。　　SS2在世界很多國家均受到重視，對它的研究主要集中在與毒力相關(guān)蛋白的研究上。溶菌酶釋放蛋白(MRP)和胞外蛋白因子(EPF)是SS2兩個主要的致病因子?！　”緦?shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^DNASt

2、ar軟件分析，克隆表達(dá)mrp和epf一段基因，驗(yàn)證該片段具有免疫原性后，通過PCR串聯(lián)兩片段并克隆表達(dá)，通過動物保護(hù)性試驗(yàn)明確串聯(lián)表達(dá)的蛋白是否具有更好的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)和協(xié)同作用機(jī)理、研制亞單位疫苗提供依據(jù)。　 本實(shí)驗(yàn)對三種抗原進(jìn)行篩選，優(yōu)化條件，建立檢測兩種豬源鏈球菌抗體的間接ELISA方法，并對豬免疫鏈球菌2價(jià)滅活苗后的抗體進(jìn)行檢測，找出抗體消長規(guī)律；每隔一定時(shí)間，分別以最小致死量強(qiáng)毒株CY與SS2-1對豬進(jìn)行攻毒

3、，探討CPS抗體水平與免疫保護(hù)之間的關(guān)系。并運(yùn)用此方法對周邊豬場的臨床血清樣品進(jìn)行了檢測。 1.豬鏈球菌2型MRP和EPF基因片段的克隆與串聯(lián)表達(dá)　　按照GenBank中的mrp、epf基因序列，利用DNAStar軟件分析，選取一段基因序列，各設(shè)計(jì)一對引物，兩端分別加限制性酶的酶切位點(diǎn)NcoⅠ、EcoRⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ，分別構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-mrp、pET32a-epf,經(jīng)克隆表達(dá)得到分子量為43kD、47

4、kD的重組蛋白，免疫印跡表明該片段是MRP、EPF的重要功能區(qū)，具有MRP、EPF的中和表位。 2.重組蛋白的免疫保護(hù)試驗(yàn)與兩毒力因子的協(xié)同作用機(jī)理　　利用重組蛋白含有的6個組氨酸殘基與Ni2+結(jié)合的特性，用Ni-NTAHis·BindResin純化，得到單一條帶的串聯(lián)表達(dá)蛋白。將融合蛋白MRP-EPF用弗氏佐劑乳化后免疫兔，同時(shí)以MRP、EPF、全菌苗SS2-1作平行實(shí)驗(yàn)?！　∵x用SEZ和SS2的全菌(WAC)、超聲波抗原