表達(dá)豬鏈球菌2型保護(hù)性抗原重組豬痘病毒的構(gòu)建、特性分析及其小鼠免疫評(píng)估.pdf

1、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis type2，SS2）可引起豬患腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎及敗血癥，同時(shí)也能感染人并導(dǎo)致死亡，是一種重要的人畜共患病病原體。豬痘病毒（Swinepox virus，SPV）在自然情況下只感染豬，并且癥狀溫和，能自行康復(fù)，其作為病毒載體有很多優(yōu)點(diǎn)，故適合用于重組疫苗的開發(fā)。本研究以SPV作為載體構(gòu)建了6個(gè)表達(dá)SS2保護(hù)性抗原的重組病毒，并對(duì)重組病毒進(jìn)行了免疫學(xué)評(píng)價(jià)。
　　 1.

2、 SPV的分離及豬痘的血清學(xué)調(diào)查
　　 用PK-15細(xì)胞在豬痘發(fā)病豬的痂皮和膿皰中分離到一株SPV。對(duì)包含SPV特異性序列在內(nèi)的三段核酸序列進(jìn)行了擴(kuò)增和測(cè)序，與SPV17077-99株相比，三段序列的核苷酸同源性分別為91％、96％和99％。此外，為了了解豬痘的流行現(xiàn)狀，利用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對(duì)來自江西、安徽、湖北、江蘇、廣東及上海共1004份成年豬血清進(jìn)行了豬痘血清學(xué)調(diào)查。結(jié)果表明，豬痘在豬群中較少發(fā)生，在被檢測(cè)的1004份樣品中只

3、有40份陽性，陽性率僅為4％,但被調(diào)查的六個(gè)地區(qū)都有分布。
　　 2.表達(dá)lacZ基因重組豬痘病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究
　　 為了驗(yàn)證兩個(gè)痘苗病毒（Vaccinia virus，VV）強(qiáng)啟動(dòng)子P11和P28在重組豬痘病毒中的活性，構(gòu)建了一個(gè)載體系統(tǒng)。利用這個(gè)系統(tǒng)獲得了兩個(gè)重組豬痘病毒rSPV-Z11和rSPV-Z28，并對(duì)這兩個(gè)重組病毒的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。在這個(gè)系統(tǒng)中，SPV基因組中SPV020和SPV021兩基

4、因間的366bp非編碼區(qū)作為產(chǎn)生重組豬痘病毒的一個(gè)新的外源基因插入位點(diǎn)，大腸桿菌的lacZ基因作為一個(gè)顯性篩選標(biāo)記。獲得的重組病毒用PCR和SDS-PAGE進(jìn)行了鑒定，并對(duì)重組病毒在PK-15細(xì)胞中的增殖能力和親本毒株進(jìn)行了比較，同時(shí)我們也分析了重組病毒的遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，lacZ基因在重組病毒中穩(wěn)定存在并能得到有效表達(dá)，重組病毒的滴度及蝕斑大小和親本病毒差異不大，說明重組病毒性狀穩(wěn)定，該366bp非編碼區(qū)的部分刪除對(duì)病毒增殖影響不

5、大，并且啟動(dòng)子P11和P28在重組病毒中有很強(qiáng)的活性，適合用于構(gòu)建疫苗用的重組豬痘病毒。
　　 3.表達(dá)綠色熒光蛋白的重組豬痘病毒的構(gòu)建及其在鼠源細(xì)胞系中的復(fù)制和表達(dá)
　　 為了探討小鼠作為豬痘病毒載體疫苗免疫學(xué)評(píng)價(jià)模型的可能性，構(gòu)建了一個(gè)表達(dá)綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)的重組豬痘病毒rSPV-G28，并對(duì)重組病毒在鼠源細(xì)胞系LLC和Hepa1-6中的復(fù)制和表達(dá)情況進(jìn)行了研究

6、。結(jié)果顯示，rSPV-G28在這兩個(gè)鼠源細(xì)胞中能夠有效表達(dá)綠色熒光蛋白，并且重組病毒能在LLC細(xì)胞中復(fù)制并產(chǎn)生子代病毒，表明小鼠可作為豬痘病毒載體疫苗免疫學(xué)評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型。
　　 4.表達(dá)豬鏈球菌2型mrp基因片段的重組豬痘病毒的構(gòu)建及免疫學(xué)評(píng)價(jià)
　　 為了探討SPV作為鏈球菌疫苗載體的潛力，構(gòu)建了一個(gè)用于獲得表達(dá)外源基因的重組豬痘病毒的載體系統(tǒng)，并用這個(gè)系統(tǒng)得到了一個(gè)表達(dá)豬鏈球菌2型mrp基因片段的重組豬痘病毒rSPV

7、-MRP。通過PCR、western blotting和間接免疫熒光檢測(cè)對(duì)rSPV-MRP進(jìn)行了鑒定。經(jīng)肌肉注射，分別用rSPV-MRP、SS2滅活疫苗（陽性對(duì)照）、SPV親本病毒（陰性對(duì)照）及PBS（空白對(duì)照）給CD1小鼠免疫3次。在最后一次免疫后的第14天，用致死劑量或亞致死劑量的SS2強(qiáng)毒菌株ZY05719攻擊CD1小鼠。結(jié)果顯示，rSPV-MRP免疫組60％的小鼠存活，顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0.05)。并且，rSPV-MRP免

8、疫組的小鼠各器官細(xì)菌含量顯著低于陰性對(duì)照組（P＜0.05）。rSPV-MRP免疫組的MRP特異性抗體滴度在檢測(cè)的所有時(shí)間點(diǎn)都顯著高于對(duì)照組(P＜0.001)。這些數(shù)據(jù)表明，rSPV-MRP能顯著保護(hù)CD1小鼠抵抗SS2強(qiáng)毒菌株的感染。因此，重組豬痘病毒有望成為豬鏈球菌疫苗用于預(yù)防豬發(fā)生鏈球菌感染。
　　 5.共表達(dá)豬鏈球菌2型SLY和MRP重組豬痘病毒的構(gòu)建及其在CD1小鼠模型中的保護(hù)效率研究
　　 利用GFP基因作為篩

9、選標(biāo)記構(gòu)建了一個(gè)用于獲得表達(dá)外源基因的重組豬痘病毒的載體系統(tǒng)，并用這個(gè)系統(tǒng)得到了兩個(gè)表達(dá)SS2保護(hù)性抗原的重組豬痘病毒rSPV-SLY和rSPV-SLY-MRP。通過肌肉注射，分別用rSPV-SLY、rSPV-SLY-MRP、SS2滅活疫苗（陽性對(duì)照）、SPV親本病毒（陰性對(duì)照）及PBS（空白對(duì)照）給CD1小鼠免疫3次。在最后一次免疫后的第14天，用致死劑量或亞致死劑量的SS2強(qiáng)毒菌株ZY05719攻擊CD1小鼠。分別在免疫的0、7、1

10、4、21、28、35、42及49天粟血用于測(cè)定小鼠的SLY和MRP特異性抗體水平。結(jié)果顯示，重組病毒免疫組的特異性抗體在一免后的第7天就顯著升高，且在加強(qiáng)免疫后持續(xù)上升。在免疫后的所有測(cè)定點(diǎn)，重組病毒免疫組的抗體滴度均顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.001），也明顯高于陽性對(duì)照組(P＜0.05)。數(shù)據(jù)還顯示，重組病毒免疫組的小鼠各器官細(xì)菌含量顯著低于陰性對(duì)照組（P＜0.05）;rSPV-SLY免疫組和rSPV-SLY-MRP免疫組的攻毒保護(hù)

11、率分別70％和100％。這些數(shù)據(jù)表明，重組豬痘病毒rSPV-SLY和rSPV-SLY-MRP能顯著保護(hù)CD1小鼠抵抗SS2強(qiáng)毒菌株的感染，可作為豬鏈球菌疫苗的候選物。
　　 6.共表達(dá)豬鏈球菌2型ECE、MRP和SLY重組豬痘病毒的構(gòu)建及其在CD1小鼠模型中的保護(hù)效率研究
　　 利用豬痘病毒作為載體構(gòu)建了三個(gè)表達(dá)SS2保護(hù)性抗原的重組病毒rSPV-ECE、rSPV-ECE-SLY和rSPV-ECE-MRP-SLY。經(jīng)肌肉

12、注射，分別用 rSPV-ECE、rSPV-ECE-SLY、rSPV-ECE-MRP-SLY、SS2滅活疫苗（陽性對(duì)照）、SPV親本病毒（陰性對(duì)照）及PBS（空白對(duì)照）給CD1小鼠免疫3次。在最后一次免疫后的笫14天，用致死劑量或亞致死劑量的SS2強(qiáng)毒菌株ZY05719攻擊CD1小鼠。分別在免疫的0、7、14、21、28、35、42及49天采血用于測(cè)定SS2保護(hù)性抗原的特異性抗體水平。結(jié)果顯示，重組病毒免疫組的特異性抗體在一免后的第7天就

13、顯著升高，且在加強(qiáng)免疫后持續(xù)上升。在免疫后的所有測(cè)定點(diǎn)，重組病毒免疫組的抗體滴度均顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.001），也明顯高于陽性對(duì)照組(P＜0.05)。數(shù)據(jù)還顯示，重組病毒免疫組的小鼠各器官細(xì)菌含量顯著低于陰性對(duì)照組(P＜0.05);rSPV-ECE免疫組的攻毒保護(hù)率為60％，rSPV-ECE-SLY免疫組和rSPV-ECE-MRP-SLY免疫組的攻毒保護(hù)率均為100％。這些數(shù)據(jù)表明，表達(dá)SS2保護(hù)性抗原的重組豬痘病毒能顯著保護(hù)C