金黃色葡萄球菌保護性抗原基因重組牛痘病毒的構(gòu)建與鑒定研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌是一種能感染多種動物的常見革蘭氏陽性球菌。病原學(xué)調(diào)查表明，金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要病原之一，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)的危害較重。為了有效預(yù)防奶牛乳房炎的發(fā)生，目前迫切需要研究有效的金黃色葡萄球菌疫苗。為此，本項目開展了以下研究工作：
　　 1.致奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌SHZ1株保護性抗原基因的克隆與序列分析：利用PCR技術(shù)從致奶牛乳房炎的金黃色葡萄球菌SHZ1株基因組中擴增出FnBP基因和ClfA基因，克隆至T

2、載體并進行測序。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌SHZ1株FnBP基因與Genbank上公布的金黃色葡萄球菌FnBP（序列號為EF127872）的核苷酸序列同源性為99.86％。核苷酸序列中有兩個堿基發(fā)生變異，但均為同義突變。金黃色葡萄球菌SHZ1株ClfA基因與Genbank上公布的金黃色葡萄球菌ClfA（序列號為EF207779）的核苷酸序列同源性為96％，氨基酸序列的同源性為100％。
　　 2.金黃色葡萄球菌FnBP基因重組牛痘

3、病毒的構(gòu)建、鑒定與純化研究：將用SamⅠ單酶切將目的基因切下，并克隆至pSC11牛痘病毒載體，測序鑒定正向連接的陽性克隆。選擇正向連接的重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pSC11-FnBP，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)染已感染牛痘弱毒株病毒的BHK-21細胞中，收獲轉(zhuǎn)染產(chǎn)物，并反復(fù)凍融，然后充分稀釋接種BHK-21細胞，利用藍白斑篩選重組牛痘病毒，連續(xù)傳代純化藍色蝕斑，結(jié)果傳代5次后得到較純的重組牛痘病毒。利用PCR技術(shù)、RT-PCR技術(shù)及Wester

4、n-blotting檢測經(jīng)純化后得到的重組牛痘病毒，證實外源基因FnBP已成功重組到牛痘弱毒株病毒基因組中，并隨著牛痘弱毒株病毒在BHK-21細胞內(nèi)的生長、繁殖而復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。
　　 3.金黃色葡萄球菌FnBP基因重組牛痘病毒的生長特性、安全性及免疫原性初步研究；利用BHK-21細胞測定非重組牛痘病毒與重組牛痘病毒的毒價（TCID50），結(jié)果表明重組外源基因的重組牛痘病毒與非重組牛痘病毒的毒價相比并沒有降低。重組牛痘病毒pS

5、C11-FnBP作為實驗組，生理鹽水和牛痘弱毒株病毒作為對照組，對小鼠進行了實驗免疫研究。通過對免疫小鼠體征及內(nèi)臟器官進行病理切片觀察，結(jié)果證實重組牛痘病毒pSC11-FnBP對免疫小鼠無任何不良反應(yīng)，具有良好的安全性。通過檢測重組牛痘病毒免疫小鼠血清中IFN-γ和測定中性粒細胞吞噬功能證實構(gòu)建的重組牛痘病毒與牛痘弱毒株病毒相比可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較好的細胞免疫。攻毒試驗表明，重組牛痘病毒對金黃色葡萄球菌具有一定的免疫保護作用。本研究為金黃色