肺炎鏈球菌糖代謝蛋白CcpA對莢膜多糖的調(diào)控研究.pdf

1、目的：
　　肺炎鏈球菌莢膜（Capsule CPS）是肺炎鏈球菌的一種重要的毒力因子，在細(xì)菌定植、粘附中發(fā)揮重要作用，可保護(hù)細(xì)菌免受宿主的吞噬殺傷作用。肺炎鏈球菌莢膜合成基因?yàn)橐徊倏v子結(jié)構(gòu)，即cps基因座，其表達(dá)水平受其上游啟動子的調(diào)控，但目前尚不清楚有哪些蛋白可通過該啟動子調(diào)控這些基因及CPS的合成。
　　我們前期研究通過DNA pulldown實(shí)驗(yàn)篩選到CcpA可能與肺炎鏈球菌莢膜多糖（CPS）基因座啟動子區(qū)域結(jié)合，且C

2、cpA（catabolite control protein A,CcpA）是一種與糖代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控了肺炎鏈球菌多種基因的表達(dá)。本研究擬通過EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CcpA與cps啟動子序列的結(jié)合，并進(jìn)一步研究其對莢膜的調(diào)控作用，為了解肺炎鏈球菌莢膜合成的分子機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法：
　　利用大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）工程菌原核表達(dá)CcpA蛋白，使用 Ni2+親和層析的方法

3、純化目的蛋白。利用純化后的CcpA蛋白免疫昆明小鼠并制備多克隆抗體；采用ELISA法測定抗CcpA抗體效價(jià)。隨后，利用Westertn blot方法分析CcpA蛋白在肺炎鏈球菌中的保守性。另外，利用EMSA方法分析CcpA與cps基因座啟動子區(qū)域片段的結(jié)合。最后，采用基因重組方法構(gòu)建ccpA基因缺失株和ccpA基因回復(fù)株；利用ELISA法測定野生D39菌株、ccpA基因缺失株和ccpA基因回復(fù)株的莢膜多糖含量。
　　結(jié)果：

4、　　首先得到了高純度（>90％）的CcpA重組蛋白且制備了CcpA多克隆抗體，Western blot結(jié)果顯示CcpA蛋白在多種血清型的肺炎鏈球菌均有表達(dá)。EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CcpA蛋白可與cps基因座啟動子區(qū)域結(jié)合，且呈劑量依賴性；ccpA基因缺失時(shí)，細(xì)菌CPS含量升高，回復(fù)表達(dá)CcpA蛋白后，CPS含量顯著降低。
　　結(jié)論：
　　我們的結(jié)果表明，CcpA是肺炎鏈球菌中一種保守表達(dá)的蛋白，可通過與cps基因座啟動子特異