14型肺炎球菌莢膜多糖純化工藝的建立與優(yōu)化.pdf

1、肺炎球菌(Streptococcus Pneumoniae，SP)，簡稱肺炎球菌，是一種具有莢膜的革蘭氏陽性菌，是導(dǎo)致全球人類發(fā)病和死亡的主要致病菌之一，主要引起社區(qū)獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎以及敗血癥等疾病。目前已有利用其保護(hù)性抗原—肺炎球菌莢膜多糖(PnPS)制備的23價肺炎球菌莢膜多糖疫苗和7價、13價肺炎球菌多糖結(jié)合疫苗上市，以防御肺炎球菌對成人和嬰幼兒造成的感染。
　　論文以14型肺炎球菌為實驗材料，采用常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢定方

2、法對其進(jìn)行了篩選，挑出生物學(xué)特性典型、莢膜結(jié)構(gòu)完整豐厚、與14型分型診斷血清凝集作用較強的31601-5菌株建立發(fā)酵的工作種子庫；以細(xì)菌生長菌密度、莢膜多糖產(chǎn)率等指標(biāo)為依據(jù)，通過細(xì)菌發(fā)酵罐培養(yǎng)，對其適宜培養(yǎng)基成分、菌液接種量以及通氣方式等條件進(jìn)行篩選與優(yōu)化。結(jié)果表明，以添加了天冬氨酸和谷氨酰胺的氨基酸培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在培養(yǎng)溫度為37℃，菌種接種量為10％、培養(yǎng)基pH值7.2、CO22 L/min及壓縮空氣3 L/min共同通氣培養(yǎng)的條件下

3、，14型肺炎球菌生長較好，菌密度達(dá)13.068，莢膜多糖產(chǎn)率可達(dá)到0.4 g/L。
　　其次，對14型肺炎球菌培養(yǎng)液的裂解工藝進(jìn)行了優(yōu)化和驗證，通過觀察裂解濃度、裂解時間、裂解溫度對裂解效果的影響，最終確立了14型肺炎球菌發(fā)酵培養(yǎng)液的裂解工藝為：細(xì)菌光密度OD600值≤12時，細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)束后，于培養(yǎng)液中加入脫氧膽酸鈉，使其終濃度為0.12%，置于18~22℃環(huán)境下靜置12~18h。
　　然后，將裂解液分別用乙醇分級沉淀法和C

4、TAB沉淀法進(jìn)行純化，并檢測氨基己糖含量、蛋白質(zhì)含量、核酸含量及免疫雙擴散法確定抗原活性，全面評價各種方法的純化效果，結(jié)果表明，乙醇分級沉淀法更適于14型肺炎球菌粗多糖的純化。
　　最后，對裂解液中的粗多糖分別用脫氧膽酸鈉法和苯酚抽提法進(jìn)行處理后超濾、干燥。收獲凍干后的莢膜多糖，經(jīng)全面分析后，確定14型肺炎球菌粗多糖的去蛋白質(zhì)工藝為脫氧膽酸鈉法。工藝參數(shù)為：加入脫氧膽酸鈉，終濃度0.5%，調(diào)pH至5.0以下，離心取上清液，經(jīng)100

5、Kd膜堆超濾后冷凍干燥收獲液。
　　論文還應(yīng)用響應(yīng)面法對14型肺炎球菌莢膜多糖的超濾工藝進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)實際操作情況及經(jīng)驗選取跨膜壓力、切向流量和多糖濃度作為自變量，以膜包處理能力作為響應(yīng)值，先進(jìn)行單因素試驗，考察跨膜壓力、切向流量、多糖濃度對膜包處理能力的影響，并初步確定曲線的拐點和試驗步長，再以單因素試驗為基礎(chǔ)，利用Box-Behnken設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化組合，采用Design Expert軟件分析數(shù)據(jù)，確定最佳超濾工藝參數(shù)為：