肺炎鏈球菌熱休克蛋白DnaJ相互作用蛋白的篩選及鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)熱休克蛋白DnaJ是一個毒力因子,但其對肺炎鏈球菌致病機制的作用尚不清楚,本文擬通過尋找DnaJ在S.pn中的相互作用蛋白來揭示其對細菌毒力的影響。
   方法:主要采用兩種蛋白質(zhì)相互作用的技術——免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)和細菌雙雜交來進行相互作用蛋白的篩選與驗證。質(zhì)粒pAE03含有標簽蛋白——綠色熒光蛋白(

2、Green Fluorescent Protein,GFP),將DnaJ整合到該質(zhì)粒上,獲得重組質(zhì)粒pAE03-dnaJ-gfp并轉(zhuǎn)化S.pn菌株D39。收集轉(zhuǎn)化細菌和野生型D39裂解液,用結合了GFP抗體的beads去捕獲帶GFP標簽的DnaJ和它結合的相互作用蛋白,捕獲蛋白質(zhì)混合物采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,

3、SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)化細菌與D39的差異蛋白質(zhì)通過基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)鑒定;然后用細菌雙雜交技術驗證這種相互作用,并通過β-半乳糖苷酶實驗和westernblot檢測熱休克時這種相互作用對候選蛋白的影響。同時,本文構建了誘餌質(zhì)粒pBT-dna

4、J和肺炎鏈球菌基因組文庫,應用細菌雙雜交技術篩選DnaJ相互作用的蛋白質(zhì)并用co-IP加以證實。根據(jù)候選蛋白的生物信息學分析結果,用最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)實驗研究該相互作用對細菌耐藥性的影響。
   結果:應用co-IP技術篩選并經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定出9個可能與DnaJ有相互作用的蛋白,包括DnaK、Gap、Eno、SpxB等。細菌雙雜交技術進一步證實了

5、DnaJ與其中3個蛋白——DnaK、Eno、SpxB間的相互作用。而p-半乳糖苷酶實驗和western blot證實,熱休克時DnaJ可以幫助Eno和SpxB正確折疊并保護它們不受降解,還可易化Eno的胞外分泌。同時,應用細菌雙雜交技術篩選到了一個DnaJ相互作用的蛋白質(zhì)——SPD1264,并通過co-IP證實兩者間確實存在相互作用。通過文獻查閱及初步的MIC實驗,表明該蛋白可能與細菌對青霉素、氨芐青霉素及卡那霉素的耐藥存在一定的聯(lián)系。

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