脂蛋白(a)與A群鏈球菌的相互作用.pdf

1、蛋白酶水解活性是許多病原生物穿越組織屏障進行擴散的重要因素，一些病原微生物可以和纖溶酶原(Plasminogen，Plg)結合，使Plg更易被宿主的纖溶酶原激活劑plasminogen activators，Pas)激活為纖溶酶(Plasmin，Pm)而水解組織屏障，還有一些病原生物可以分泌某些Pas，進而激活吸附在其表面的Plg。因此可以說，Plg是病原菌致病的重要因子。
　　 脂蛋白(a)[Lipoprotein(a)，Lp

2、(a)]中的載脂蛋白Apo(a)與Plg有高度同源性，因此，Lp(a)可以影響纖溶系統(tǒng)而成為心血管疾病的獨立危險因子。近年來許多報道指出，Lp(a)可以抑制Plg與其受體(如纖維蛋白原)的結合或抑制纖溶酶原的激活，因此，課題組首次提出了Lp(a)可以干擾病原菌利用纖溶酶原系統(tǒng)致病，指出Lp(a)可能有抗病原微生物感染的作用。
　　 A群鏈球菌(group A streptococcus，GAS)是人類的重要致病菌之一。人Plg是

3、GAS致病的重要參與因子，其中GAS表面a-烯醇化酶(surface enolase，SEN)與Plg有較強的結合，本研究從M6血清型GAS菌株中克隆了SEN基因，構建了全長(SEN)和敲掉C末端賴氨酸殘基(SENA434-435)的表達載體，并在大腸桿菌BL21中表達了此兩種重組蛋白(rSEN，rSENA434-435)。由于在重組蛋白的N末端連有6個組氨酸的標簽(His-Tag)，因此利用鉆離子螫合瓊脂糖凝膠分離純化了此兩種重組蛋白

4、。
　　 采用ELISA、親和色譜層析以及Western blot實驗證實：rSEN能和Lp(a)結合，且6氨基己酸(EACA)可以抑制結合，而rSEN△434-435不能與Lp(a)結合，說明rSEN的C末端賴氨酸殘基和Lp(a)上的賴氨酸結合位點(lysine binding site,LBS)是rSEN與Lp(a)結合的位點。為了進一步驗證這一結果。本研究也克隆表達了Apo(a)中含有LBS的KIV10結構域(rKIV10

5、)。并用ELISA證明了rKIV10可以與rSEN特異性結合，而不能與rSEN△434-43結合。另外，Lp(a)與rKIV10都能夠抑制rSEN與Plg的結合。因而，本研究首次從分子水平證明了Lp(a)可能干擾Plg系統(tǒng)而發(fā)揮抗感染作用。
　　 為了進一步探討Lp(a]的抗感染假設，本研究進行了M6血清型GAS菌株(以下簡稱為M6)與Lp(a)的相互作用，證明了Lp(a)可以和M6結合，并能夠抑制M6與Plg的結合和與Plg的

6、共孵育激活，在體外證實了Lp(a)可能的抗感染作用。
　　 本研究還通過EACA抑制M6與Lp(a)的結合實驗、蛋白酶K消化處理等實驗初步證明了Lp(a)是通過其中的LBS與M6表面蛋白的賴氨酸結合的。但由于M6表面有多種蛋白，且Plg受體表達種類和數目也不能確定,因此未能清晰地確定M6表面的Lp(a)受體。下一步實驗有望通過構建表達去除C末端賴氨酸殘基的SEN的M6突變體，并進行其與Lp(a)的結舍作用來進一步確定M6上的Lp

7、(a)結合位點。
　　 總之，本研究首次證明了rSEN能夠與Lp(a)結合,并明確了rSEN的C末端賴氮酸殘基和Lp(a)中的LBS是其結合的主要位點。Lp(a)/rKIV10能夠抑制rSEN與Plg的結合,首次從分子水平證明了Lp(a)可能干擾Plg系統(tǒng)而發(fā)揮抗感染作用。也對Lp(a)抗其它病原菌感染的機制探討或感染防治提供了可能的研究思路或技術手段。本研究也首次在國際上發(fā)現Lp(a)通過其賴氨酸結合位點與M6血清型GAS結合