肺炎鏈球菌DnaJ對(duì)細(xì)菌毒力的影響及其在誘導(dǎo)宿主天然免疫反應(yīng)中的作用.pdf

1、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)是一種常見的革蘭陽性條件致病菌，其引起的肺炎、腦膜炎和敗血癥等疾病在全球有很高的發(fā)病率和死亡率。近20年研究發(fā)現(xiàn)S.pn的許多蛋白，可作為炎癥介質(zhì)或直接損傷宿主組織，且編碼這些蛋白的基因突變后，細(xì)菌的毒力顯著下降，因此S.pn的毒力蛋白在肺炎鏈球菌感染的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。
　　細(xì)菌由外界環(huán)境進(jìn)入宿主后必然面臨生存條件的改變，它們會(huì)應(yīng)激性地調(diào)整基因表達(dá)以適應(yīng)

2、環(huán)境的選擇壓力，細(xì)菌的熱休克蛋白(HeatShock Protein，HSP)正是應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的一組對(duì)細(xì)菌本身具有保護(hù)作用的相關(guān)蛋白。從理論上講，這些應(yīng)激表達(dá)的HSP往往是細(xì)菌潛在的毒力因子。因此全面理解肺炎鏈球菌HSP對(duì)自身毒力的影響及其與宿主免疫細(xì)胞間的相互作用將有助于抗肺炎球菌感染的新型治療試劑的開發(fā)。
　　DnaJ/Hsp40蛋白就是一種高度保守并廣泛存在的熱休克蛋白，作為DnaK的共分子伴侶，激活DnaK的ATPase活

3、性。S.pn的DnaJ蛋白是一種表面蛋白，已有研究顯示該蛋白具有疫苗的潛力，腹腔或粘膜接種使宿主產(chǎn)生抵抗多種血清型S.pn感染的獲得性免疫反應(yīng)。但是，DnaJ蛋白是否參與細(xì)菌致病以及DnaJ蛋白與宿主天然免疫細(xì)胞的相互作用尚不清楚。
　　本研究分別從體內(nèi)、體外兩方面觀察肺炎鏈球菌dnaJ缺陷對(duì)自身毒力的影響及DnaJ在誘導(dǎo)宿主天然免疫反應(yīng)中的作用--促炎因子的分泌，模式識(shí)別受體(PRR)對(duì)DnaJ蛋白的識(shí)別，信號(hào)通路的激活。研究?jī)?nèi)

4、容包括以下三個(gè)部分：
　　1、構(gòu)建.S.pn的dnaJ基因缺失的突變體，觀察溫度應(yīng)激時(shí)其體外生長情況，為后續(xù)研究DnaJ在細(xì)菌和與宿主相互作用中所扮演的角色提供實(shí)驗(yàn)菌株和技術(shù)平臺(tái)。
　　采用長臂同源多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LFH-PCR)方法，制備中間為紅霉素耐藥基因(erm)，兩側(cè)為dnaJ基因上、下游同源序列的連接片段，轉(zhuǎn)化肺炎鏈球菌D39或R6菌，在含紅霉素的血平板上篩選并采用PCR及測(cè)序鑒定缺陷菌株。結(jié)果顯示缺陷菌株的dna

5、J基因完全被erm基因替代；革蘭染色后形態(tài)無變化，但其菌落明顯變?。?0℃和37℃時(shí)體外生長曲線與野生菌大體一致，但20℃和40℃時(shí)生長明顯受抑制，幾乎不能生長。
　　2、分別從體內(nèi)、體外兩方面觀察肺炎鏈球菌dnaJ缺陷對(duì)自身毒力的影響。
　　腹腔攻毒后直接觀察感染野生菌或缺陷菌小鼠的生存情況；滴鼻感染S.pn建立小鼠肺炎模型，計(jì)數(shù)易感組織的細(xì)菌載量，明確dnaJ缺陷對(duì)細(xì)菌自身定植能力的影響；將S.pn感染小鼠肺上皮細(xì)胞ML

6、E12，比較野生和缺陷菌株黏附及侵襲能力的差異。毒力實(shí)驗(yàn)顯示dnaJ缺陷菌組的小鼠可耐受致死劑量的S.pn并長期存活；定植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺陷菌組小鼠鼻咽部和肺部的細(xì)菌載量均顯著低于野生菌組，并迅速清除入血的缺陷菌；dnaJ缺陷使S.pn對(duì)MLE12細(xì)胞的黏附侵襲能力顯著減弱，而且用抗DnaJ抗血清預(yù)處理MLE12后野生菌對(duì)該細(xì)胞的黏附能力明顯下降。
　　3、明確S.pn dnaJ基因缺陷后宿主或免疫細(xì)胞對(duì)該菌天然免疫反應(yīng)的變化，再從分子

7、水平篩選宿主識(shí)別DnaJ誘導(dǎo)先天性免疫的模式識(shí)別受體和下游信號(hào)通路。
　　建立小鼠S.pn的肺炎模型，取感染肺組織切片染色觀察炎癥反應(yīng)，定量PCR和ELISA檢測(cè)促炎因子的表達(dá)；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7感染S.pn，比較該細(xì)胞對(duì)野生菌和缺陷菌的吞噬能力及炎癥因子分泌水平；原核表達(dá)并純化DnaJ全長蛋白刺激RAW264.7，檢測(cè)促炎因子的水平，定量PCR篩選識(shí)別DnaJ蛋白的TLRs，并用抗TLRs單抗驗(yàn)證，蛋白激酶抑制劑篩選D