樹突細(xì)胞和調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的研究進(jìn)展

1、基因公司市場部張 姿,DC細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞研究新進(jìn)展,樹突細(xì)胞篇,樹突細(xì)胞（Dendritic Cell；DC）,樹突細(xì)胞根據(jù)其獨(dú)特形態(tài)而得名, 是目前功能最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞(APC),,,Important surface molecules of DC,樹突細(xì)胞膜表面分子,MHC-II,黏附分子,CD1a 抗原呈遞,,DC的起源和分類,小鼠體內(nèi)DC根據(jù)其起源、功能和分布情況主要分為髓系DC和淋巴系DC兩種，分別用CD1

2、1b和CD45R/B220區(qū)分人體DC至少可以分為與小鼠類似的兩群：DC1和DC2外周血前體細(xì)胞可分為來源于外周血單個(gè)核細(xì)胞的前體細(xì)胞pDC1和來源于血液或者扁桃體的類漿細(xì)胞的前體細(xì)胞pDC2,人DC分類,髓樣DC(MDC)不表達(dá)lin(CD19、CD20、CD56、CD14、CD3) 但高表達(dá)HLA-DR及CD11c;漿細(xì)胞淋巴樣DC(PDC) 不表達(dá)lin(CD19、CD20、CD56、CD14、CD3) 高表達(dá)H

3、LA-DR及CD123. 活化DC上調(diào)CD40 、CD80 、CD86,人外周血樹突細(xì)胞髓系和淋巴系亞群分析,人外周血DC主要分為CD123+和CD11＋亞群 3-color assaylin 1 FITC (Cat No. 340546)、CD123 PE (Cat No. 554529)、CD11C PE (Cat No. 555392)、Anti–HLA-DR PE-Cy5 (Cat No. 555813)、Mouse

4、 IgG1 PE (Cat No.555749)、Mouse IgG2a PE (Cat No.555574) 4-color assaylin 1 FITC、CD123 PE 、CD11c APC (Cat No. 559877)、Anti–HLA-DR PerCP、Mouse IgG1 PE 、Mouse IgG2a APC(Cat No.555576),人外周血DC1和DC2的鑒定,4-Color AssayR

5、3: lin-HLA-DR-CD123+嗜堿性粒細(xì)胞R4：lin-HLA-DR+CD123+淋巴系細(xì)胞DC（DC2）R5：lin-HLA-DR+CD11C+髓系DC（DC1）,小鼠DC分型,名稱 貨號Anti-mouse B7-DC (CD273) PE 557796Rat IgG2a, κPE isotype control 554689anti-mou

6、se CD11b FITC 553310 / 557396anti-mouse CD11c APC 550261 CD45/B220 PerCP 553093Anti-mouse IFN-PE 554412,Splenic dendritic cells (DCs)

7、express B7-DC (Nguyen, L.T., et al.. 2002.J. Exp. Med.),DC的生物學(xué)特征,DC主要激活靜息型Tcell, 也可誘導(dǎo)繁殖型T細(xì)胞激發(fā)獲得性免疫Diaz-de-Durana et al. (Blood.2006)等發(fā)現(xiàn) DC與B細(xì)胞之間通過BLys激活B細(xì)胞和嵌合的Fc-TACI蛋白信號促使DC成熟DC激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、NK-T細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞引發(fā)自然殺傷反應(yīng)淋巴系DC

8、通過快速分泌IFN-α和IFN-β對特定病毒產(chǎn)生應(yīng)答DC與Th細(xì)胞的關(guān)系,DC的分化過程,成熟和未成熟DC比較,DC的表型分析,體外培養(yǎng)的MDDC (Monocyte derived DCs) 表型分析BDTM CD86/CD209 /CD83 組合CD209 PE Cat.No. 551265CD86 PE-Cy5 Cat.No. 555659/555666CD83 APC

9、 Cat.No. 551073 CD14 Alexa Fluor 488 (Cat. No. 557700),DC功能分析,DC功能分析主要包括胞內(nèi)外細(xì)胞因子檢測和混合淋巴細(xì)胞刺激反應(yīng)胞內(nèi)流式：胞內(nèi)細(xì)胞因子：BD Cytometric Beads Array (CBA)：胞內(nèi)外細(xì)胞因子同種混合淋巴細(xì)胞刺激反應(yīng)(Allo-MLR) ：用細(xì)胞因子流式法結(jié)合BrdU摻入法檢測DC刺激同種異體T細(xì)胞的能力同源的抗原特異性T細(xì)

10、胞的刺激能力：同上,舉例1：MDDC胞內(nèi)因子COX分析,LPS炎性刺激誘導(dǎo)未成熟MDDC大量表達(dá)COX-2，而成熟MDDC組成性表達(dá)COX-2,外周血DC,舉例2：外周血DC和MDDC對LPS 應(yīng)答產(chǎn)生IL-12,舉例3：CBA檢測DC細(xì)胞因子,Cytometric bead array 檢測Ly49Q+和Ly49Q– 小鼠類漿細(xì)胞前體DC分泌細(xì)胞因子的能力,(Omatsu Y, Iyoda T, Kimura Y et al. J.

11、Immunol. 2005 ),舉例4：MDDC的同種混合淋巴細(xì)胞刺激反應(yīng),小鼠DC研究相關(guān)Marker,P plasmacytoid DC M myeloid (conventional) Mat mature DC imm immature >表達(dá)高于,人類DC分析相關(guān)Marker,DC的獲取和培養(yǎng),CD34+祖細(xì)胞位于骨髓、臍帶血和成年人外周血中，在細(xì)胞因子如GM-CSF、TNF-α培養(yǎng)條件下可以發(fā)育為DC外

12、周血CD14 + 單核細(xì)胞在GM-CSF 和IL-4 的條件下可以分化發(fā)育成DC，現(xiàn)多采用，主要因?yàn)槿〔膹V泛、培養(yǎng)方便外周血中CD34-前體細(xì)胞可以誘導(dǎo)出大量的DC，具有成熟DC所有的特征高度純化的乳鐵蛋白陽性的終末期中性粒細(xì)胞的前體細(xì)胞加入GM-CSF、IL-4和TNF-α可形成DC 樣細(xì)胞白血病細(xì)胞成功誘導(dǎo)出DC, 具有較強(qiáng)的刺激混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)能力,組織來源 骨髓 新生兒臍帶血 流動的外周血干細(xì)胞 貼

13、壁外周血細(xì)胞分離方法 密度純化法（density-based purification） 磁分選和免疫分選 使用鈣離子篩（calcium ionophore,CI）,DC的體外分離,BD IMAG 樹突細(xì)胞磁分離系統(tǒng),常用的細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4 、TNF-α其他刺激因子IL-1β、IL-6、PGE-2、IL-13、SCF、Flt-3配基、CD40L、TGFb、c-kit配體肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte

14、 growth factor; HGF)、PMA 培養(yǎng)輔助試劑Mouse BD FcBlock? purified CD16/CD32 mAb Cat. no. 553141/553142 human GM-CSFCat. no. 550068human IL-6 Cat. no. 550071 mouse GM-CSF Cat. no. 554586mouse IL-6Cat. no. 554

15、582 rat GM-CSF Cat. no. 555111rat IL-6Cat. no. 557008 human IL-4Cat. no. 554605human TNF Cat. no. 554618 mouse IL-4 Cat. no. 550067mouse TNF Cat. no. 554589 rat IL-4 Cat. no. 555107rat TNF

16、Cat. no. 555109 mouse IL-13Cat. no. 554599,培養(yǎng)條件,外周血單核細(xì)胞體外培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生DC,HBV慢性感染主要原因,,HBV特異細(xì)胞免疫功能的低下,,,,,T細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞（DC）,慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能異常,促進(jìn)DC成熟、恢復(fù)DC的功能,,增強(qiáng)DC激活特異性抗病毒免疫反應(yīng),,打破免疫耐受徹底清除病毒,,研究示例,特異性CTL數(shù)量少低反應(yīng),,,,,,獲得高頻數(shù)、

17、功能強(qiáng)HBV特異性的CTL,DC疫苗,前列腺癌樹突狀細(xì)胞疫苗已經(jīng)完成III 期臨床研究我國大腸癌DC治療性疫苗進(jìn)入II期臨床Baylor免疫研究所獲得3千萬美元資助進(jìn)行黑素瘤疫苗的研制2002年，中法合作用DC疫苗成功治療猴艾滋病2006年，華裔科學(xué)家何大一獲蓋茨基金會2500萬研究艾滋病DC疫苗新型丙肝疫苗糖尿病的DC治療進(jìn)入FDA臨床I安全性期檢測,DC與腫瘤的關(guān)系,DC腫瘤疫苗的原理：在體外被腫瘤負(fù)載的DC所誘導(dǎo)的T

18、淋巴細(xì)胞反應(yīng)是腫瘤特異性的，且對自身淋巴細(xì)胞無直接損傷；腫瘤病灶中的浸潤型DC可以處理和提呈抗原并激活抗腫瘤免疫腫瘤的免疫主要逃逸的機(jī)制：腫瘤病人中DC數(shù)量減少和功能缺陷，無法激發(fā)細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）DC疫苗正取代其他治療癌癥的方法,DC腫瘤疫苗的制備,臨床治療DC準(zhǔn)備的QC標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞純度（血液來源的DC）>70% (lin-DR+)細(xì)胞純度 (MDDC)>90% (CD14-lin-DR+)細(xì)胞純度

19、(骨髓來源的DC)> 50% (CD34+)活化DC標(biāo)志> 80% CD86和CD83依賴于操作活性>90% (新鮮)>50% (冰凍)功能刺激T 細(xì)胞的能力-同種抗原-特定抗原 抗原負(fù)載DC的策略合成抗原肽沖擊DC腫瘤完整抗原或者腫瘤裂解物沖擊DC凋亡或者壞死的腫瘤細(xì)胞沖擊DC完整的腫瘤細(xì)胞融合DC載體轉(zhuǎn)染mRNA沖擊DC刺

20、激性因子或者共刺激因子基因轉(zhuǎn)染,DC疫苗存在問題和展望,1．成熟或未成熟DC?2．DC來源 單個(gè)核細(xì)胞源性或CD34+前體細(xì)胞源性DC和外周血DC 3．DC劑量 大多數(shù)報(bào)道中DC劑量為1×106~5×107個(gè)細(xì)胞，長效地刺激免疫反應(yīng)劑量？4．抗原選擇目前尚無定論5．輸入途徑靜脈、淋巴結(jié)和腫瘤部位,參考文獻(xiàn),Xie J, Wang Y, et al.. Beta 2-microgl

21、obulin as a negative regulator of the immune system: high concentrations of the protein inhibit in vitro generation of functional dendritic cells. Blood. 2003 15:4005-12. Davidson DJ, Currie AJ, et al..The cationic anti

22、microbial peptide LL-37 modulates dendritic cell differentiation and dendritic cell induced T cell polarization. J Immunol. 2004 15:1146-56.Su Z, Dannull J, et al.. Telomerase mRNA-transfected dendritic cells stimulate

23、antigen-specific CD8+ and CD4+ T cell responses in patients with metastatic prostate cancer. J Immunol. 2005 15; 3798-807.Galea-Lauri J, Wells JW, et al..Strategies for antigen choice and priming of dendritic cells infl

24、uence the polarization and efficacy of antitumor T-cell responses in dendritic cell-based cancer vaccination. Cancer Immunol Immunother. 2004 53:963-77.Pillarisetty VG, Shah AB, et al..Liver dendritic cells are less imm

25、unogenic than spleen dendritic cells because of differences in subtype composition. J Immunol. 200415:1009-17.Samsom JN, van Berkel LA, et al..Fc gamma RIIB regulates nasal and oral tolerance: a role for dendritic cells

26、. J Immunol. 2005 174:5279-87.Omatsu Y, Iyoda T, et al..Development of murine plasmacytoid dendritic cells defined by increased expression of an inhibitory NK receptor, Ly49Q. J Immunol. 2005 174:6657-62.Rohn TA, Boes

27、M, et al..Upregulation of the CLIP self peptide on mature dendritic cells antagonizes T helper type 1 polarization. Nat Immunol. 2004 5:909-18,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞篇,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介紹,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是具有免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞, 其作用的使機(jī)體能通過免疫耐受控制自身性疾病,調(diào)節(jié)T分類及生物學(xué)特

28、征,人體中有CD4＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD8＋調(diào)節(jié)性細(xì)胞和Th3細(xì)胞、Tr1細(xì)胞天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞經(jīng)自身抗原刺激后在胸腺內(nèi)被陽性選擇，對自身抗原具有高親和力占CD4＋T細(xì)胞群體的5-10％抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖Tr1和Th3在外周發(fā)育，表型都為CD4+CD25-FoxP3-，體外用TGFb刺激可轉(zhuǎn)化為 CD4+CD25+FoxP3+CD8+調(diào)節(jié)T研究還不充分，有報(bào)道稱它經(jīng)CD3刺激后可抑制CD4＋T細(xì)胞

29、的增殖,調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,天然Treg 通過接觸抑制方式抑制T細(xì)胞的活化和增殖分泌細(xì)胞因子IL-10和TGF-β抑制免疫反應(yīng) Trl和TH3主要是通過分泌IL-10和TGF-β來下調(diào)免疫反應(yīng),細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),天然調(diào)節(jié)T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中的作用,Treg細(xì)胞分析三個(gè)階段,,CD4+CD25+,,CD4+CD25+FOXP3+,T細(xì)胞活化后也表達(dá)CD25,,FOXP3過度表達(dá)會引起機(jī)體的免疫應(yīng)答下降，它是一個(gè)調(diào)節(jié)T細(xì)胞

30、活性的主要轉(zhuǎn)錄因子,CD127+CD4+CD25+,Nature Reviews Immunology 6, 572 (August 2006),The authors concluded that using a combination of CD4, CD25 and CD127 results in highly purified T regCell population.,CD127表達(dá)識別人調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,最新發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

31、下調(diào)表達(dá)CD127。CD127是IL-7受體一部分，在T細(xì)胞前體、B細(xì)胞前體、成熟T細(xì)胞、成熟單核細(xì)胞其他一些淋系和髓系細(xì)胞上表達(dá)。IL-7R在T細(xì)胞的增殖和分化和成熟中起重要作用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞活化后CD127蛋白下調(diào)表達(dá)，且T細(xì)胞CD127的下調(diào)表達(dá)與CD25中等-強(qiáng)表達(dá)具有良好的相關(guān)系通過胞漿FoxP3染色證實(shí)CD127可用于識別調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,FoxP3與CD127的相互作用,通過ChIP和Affymetrix芯片技

32、術(shù)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxP3與CD127（IL-7R）的基因序列結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。從而也證明了Foxp3陽性與CD127低表達(dá)有相關(guān)性。,流式分析人外周血單核細(xì)胞中Treg,( J. Exp. Med. 2006;1701-1711),1、明顯優(yōu)于檢測胞漿內(nèi)FoxP3 ，排除破膜影響，適用于體外培養(yǎng)與分析2、分選所得的T 調(diào)節(jié)性細(xì)胞得率明顯增加，一般CD4+CD25+其得率往往在0.6%到7.9%之間；使用低表達(dá)CD127 聯(lián)合CD25，

33、結(jié)合設(shè)門方法可獲得CD25 低表達(dá)的調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞，從而使得率提高2-4 個(gè)數(shù)量級而不含有CD25 中等表達(dá)的非調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞。,CD127代替Foxp3的優(yōu)勢,CD127loCD25hi-int 與FoxP3陽性一致使Treg得率增加2-4個(gè)數(shù)量級分析后細(xì)胞仍然存活方便細(xì)胞分選和后期培養(yǎng)操作簡單，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠,調(diào)節(jié)T細(xì)胞與I型糖尿病關(guān)系,今年6月發(fā)表在J. Exp. Med. 2006的文章通過流式計(jì)算正常人和糖尿病病人血中

34、T reg的含量發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)T對效應(yīng)T的抑制作用,Results are represented as counts per minute (CPM),通過T reg與T 效應(yīng)細(xì)胞在cell culture insert進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)T reg是通過細(xì)胞接觸的方式抑制效應(yīng)T 細(xì)胞活化增殖的。,風(fēng)濕性患者中調(diào)節(jié)T的水平,干癬性關(guān)節(jié)炎(PsA ）脊柱關(guān)節(jié)病 （SPA）幼年型特發(fā)性關(guān)節(jié)炎（JIA）,風(fēng)濕性患者調(diào)節(jié)T的細(xì)胞因子表達(dá)水平,a.EL

35、ISA ; b. CBA用CD25++CD4+的調(diào)節(jié)T培養(yǎng)以后效應(yīng)T細(xì)胞的細(xì)胞因子的水平發(fā)生變化,Treg研究路線,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分離純化之完整解決方案,,CD4/CD127/CD25抗體組合,,,,,,五五折,六折,已知的調(diào)節(jié)T免疫表型,體外克隆擴(kuò)增,Anti-CD3IL-2Anti-CD28Anti-CD152(CTLA4)Anti-GITR,Treg應(yīng)用前景,自身免疫病超敏反應(yīng)Th1或Th2介導(dǎo)的疾病,炎癥性腸病移

36、植免疫支氣管哮喘 口服耐受及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎,實(shí)例,CD127相關(guān)參考文獻(xiàn),Liu, W. et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J. Exp. Med. 203, 1701–1711 (2006)Seddiki, N. et al. Expres

37、sion of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J. Exp. Med. 203, 1693–1700 (2006)Sharon Ahmad.Regulatory T cells: In hot pursuit. Nat. Rev. Immunol. 6, 572 (A