干細(xì)胞調(diào)控CD45RB+調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞在同種異體心臟移植中的作用.pdf

1、第一部分大鼠BMSCs對DCs表型的影響及CD45RB+DCs免疫功能的檢測
　　目的：研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone mesenchymal stem cell，BMSCs)對同種異體骨髓來源的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)表型的影響，以及受影響顯著的CD45RB+DC亞細(xì)胞群的免疫狀態(tài)。
　　方法:Wistar大鼠的BMSCs和同種異體骨髓來源的樹突狀細(xì)胞（DCs）在體外按等比例進(jìn)行5d的共培養(yǎng)

2、。根據(jù)是否加入BMSCs共同培養(yǎng)，我們將實(shí)驗(yàn)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)組別：A組：內(nèi)毒素脂多糖（LPS）與DCs共培養(yǎng)組，B組：在A組基礎(chǔ)上加入BMSCs與DCs共培養(yǎng)組（細(xì)胞數(shù)量1：1）。對兩組DC細(xì)胞表面的主要免疫標(biāo)志物分子的變化情況應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測定和分析，同時(shí)觀察DCs在光鏡下形態(tài)學(xué)上的改變。
　　利用流式細(xì)胞技術(shù)分離出大鼠BMSCs誘導(dǎo)的CD45RB+DC細(xì)胞群，實(shí)驗(yàn)組共分三組：A組：未成熟DC組，B組：CD45RB+D

3、C組，C組：成熟DC組。檢測各組細(xì)胞表面主要共刺激分子（CD80、CD86、MHC-II）的表達(dá)，各組DC攝取抗原的能力（對bead-OVA復(fù)合物的攝取）、qPCR方法測各組DC細(xì)胞中FOXP3 mRNA的表達(dá)，Western Bloting檢測各組Foxp3蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：和對照組相比，CD45RB、lLT4的表達(dá)在BMSCs共培組中 DCs表面表達(dá)發(fā)生上升，而CD86、MHC-II的表達(dá)出現(xiàn)下降；同時(shí)，CD45RB+組

4、低表達(dá)共刺激分子CD80、CD86和MHC-II，呈現(xiàn)出未成熟DC的表征；與此同時(shí)CD45RB+組與未成熟DC組的攝取能力也要強(qiáng)于成熟DC組（P<0.05），CD45RB+DC組與imDC組FOXP3 mRNA及Foxp3蛋白的表達(dá)均明顯多于mDC組（P<0.05）。
　　結(jié)論：BMSCs體外誘導(dǎo)下可以使DCs表面CD45RB與ILT4的表達(dá)上調(diào)，并導(dǎo)致CD86與MHC2的表達(dá)下調(diào)，尤其以CD45RB的改變最為明顯。經(jīng)BMSCs誘

5、導(dǎo)的CD45RB+DCs攝取抗原的能力明顯增強(qiáng)，其FOXP3 mRNA及Foxp3蛋白的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，呈現(xiàn)出imDC的免疫行為特征。
　　第二部分CD45RB+DCs對T細(xì)胞功能影響的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：通過體外DCs細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)，分別檢測不同DCs細(xì)胞對T淋巴細(xì)胞增殖能力的影響和其對T淋巴細(xì)胞亞群的影響。
　　方法：用Wistar大鼠的DCs和SD大鼠的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，包括以下幾組。A組：c

6、on組為陰性對照組，即SD大鼠的CD4+T細(xì)胞，B組：conA為陽性控制組，即SD大鼠分選后的CD4+T細(xì)胞給予conA刺激（濃度10ng/ml），C組：在conA陽性控制組的基礎(chǔ)上，加入Wistar大鼠未成熟DCs進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)（DC：T=1:10），D組：在conA陽性控制組的基礎(chǔ)上，加入Wistar大鼠CD45RB+DCs進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)（DC：T=1:10），E組：在conA陽性控制組的基礎(chǔ)上，加入Wistar大鼠成熟DCs進(jìn)行細(xì)

7、胞共培養(yǎng)（DC：T=1:10）。
　　共培養(yǎng)72h后，取各組CD4+T細(xì)胞進(jìn)行功能檢測，包括以CCK-8法測定T淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增情況；初始Th細(xì)胞向Th1、Th2、Th17、Treg的分化：提取RNA之后采用qPCR分別測定相應(yīng)的特異轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3的表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測各組CD4+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量。流式CBA法檢測培養(yǎng)上清中的IL-2、lL-4、IL-10、lL-17A、lFN-γ、T

8、NF-α和lL-6等細(xì)胞因子表達(dá)水平。
　　結(jié)果：細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD45RB+DCs組T細(xì)胞增殖能力明顯下降，組間有顯著差異；同時(shí)CD45RB+DCs組CD4+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量增加，與對照組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；CD45RB+DCs組和imDCs組特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXP3和T-bet表達(dá)上升，GATA-3和R0Rγ表達(dá)下降，lL-2和lFN-γ水平降低，lL-4、lL-10以及TGF-β1水平升高，與對照組間存在

9、明顯差別（P<0.05）。
　　結(jié)論：大鼠CD45RB+DCs在體外明顯抑制反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的增殖，促進(jìn)初始Th0細(xì)胞向Th2的方向分化傾斜，并能提升調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例，進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫抑制能力。
　　第三部分 CD45RB+DCs靜脈輸注誘導(dǎo)同種移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：研究大鼠CD45RB+DCs移植預(yù)處理方法誘導(dǎo)大鼠同種異體心臟移植免疫耐受的作用。
　　方法：首先建立Wistar大鼠幼鼠至SD大

10、鼠同種異體頸部心臟移植模型。在移植的5天前，對受體大鼠進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞靜脈注射。分組：A組（對照組）：只行頸部同種異位心臟移植；B組（imDCs注射組）：受體大鼠經(jīng)靜脈注射供體大鼠未成熟DC細(xì)胞1×106/0.2ml；C組（CD45RB+DCs注射組）：受體大鼠經(jīng)靜脈注射供體大鼠CD45RB+DC細(xì)胞1×106/0.2ml；D組（mDCs注射組）：受體大鼠經(jīng)靜脈注射供體大鼠成熟DC細(xì)胞1×106/0.2ml。用觸診法監(jiān)測移植心臟的存活時(shí)間

11、。分別在移植后的第1、3、5d將移植物中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離并提取RNA，對microRNA-182、microRNA-183、microRNA-7a、microRNA-155、microRNA-434、lL-2、lFN-γ、lL-4、lL-10的表達(dá)水平用定量RT-PCR進(jìn)行測定。另外分別取受體血清，流式細(xì)胞技術(shù)測定 CD4+Foxp3+T淋巴細(xì)胞的比值。
　　結(jié)果：同種異體心臟移植之后，CD45RB+DCs組和未成熟DCs組移植

12、物存活時(shí)間延長明顯，與對照組相比差異顯著（P<0.05），隨著時(shí)間的推移，CD4+Foxp3+T淋巴細(xì)胞比率呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，在術(shù)后第5d改變明顯（P<0.05）。隨著心臟移植后時(shí)間的推移，microRNA-7a、microRNA-182以及microRNA-183水平逐漸升高，miR-434表達(dá)水平則逐漸降低，在移植后的不同時(shí)間點(diǎn)上均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但同一天各組間未見明顯差別。第3、5d CD45RB+DCs組和imDCs組microR

13、NA-155表達(dá)增加，和對照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。心臟移植后得第5d，lL-4水平在CD45RB+DCs組和未成熟DCs組中的表達(dá)均上升，lL-2和lFN-γ水平則呈現(xiàn)下降趨勢，與對照組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.01）；同時(shí)IL-10水平在CD45RB+DCs組升高明顯，與對照相比有明顯差異（P<0.01）。
　　結(jié)論：CD45RB+DCs通過上調(diào)體內(nèi)CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量，下調(diào)移植受體大鼠micr