Ad-IL-12p35siRNA轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)同種小鼠心臟移植耐受.pdf

1、目的：培養(yǎng)小鼠骨髓樹突狀細(xì)胞(dendriticcells，DC)，構(gòu)建有白細(xì)胞介素12(IL-12)siRNA基因的，能在樹突狀細(xì)胞(DC)表達(dá)的重組腺病毒載體，探討IL-12siRNA(IL-12p35siRNA，IL-12p40siRNA)重組腺病毒載體感染樹突狀細(xì)胞后對其功能的影響及其在誘導(dǎo)同種小鼠心臟移植耐受中的作用。 方法：無菌制備C57BL/6小鼠骨髓，依次用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，通過半粘附法去除T、B細(xì)胞，又在

2、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)協(xié)同誘導(dǎo)下培育,DC前體分化發(fā)育成DC并擴(kuò)增。在第7天用脂多糖(LPS)刺激24h，檢測細(xì)胞因子IL-12濃度及細(xì)胞表面標(biāo)志CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ。構(gòu)建攜帶有IL-12p35siRNAcDNA，IL-12p40siRNAcDNA，HKcDNA(陰性對照)重組腺病毒質(zhì)粒(Ad-IL-12p35siRNA,Ad-IL-12p40siRNA,Ad-HKsi

3、RNA)，同時感染DC。檢測DC表面標(biāo)志物CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ類分子的表達(dá)，觀察IL-12p35亞基mRNA、IL-12p40亞基mRNA和IL-10mRNA的表達(dá)，檢測上清中IL-12p70和IL-10水平。重組腺病毒感染后DC與同種小鼠T細(xì)胞行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，同時測定上清中IL-4和IFN-γ濃度。同種小鼠異位心臟移植前7d經(jīng)尾靜脈注射Ad-IL-12p35siRNA，Ad-HKsiRNA處理的供者DC,觀察移

4、植心臟存活時間以及受鼠血清中TH1和TH2細(xì)胞因子的變化。 結(jié)果：DC細(xì)胞數(shù)增加，其形態(tài)在光鏡下多為特征性星形，也有梭形和多角形；至培養(yǎng)第9天DC細(xì)胞表面標(biāo)志CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ陽性率分別為74.90±14.36％、60.09±10.54％、57.77±11.78％和55.78±14.24％，IL-12濃度較未用LPS組明顯增加(P＜0.01)。重組腺病毒載體經(jīng)形態(tài)學(xué)、病毒DNA酶切、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和

5、逆轉(zhuǎn)錄(RT)等方法的鑒定，證實(shí)了載體構(gòu)建的正確性，經(jīng)測定病毒滴度為2.0×109pfu/ml。IL-12p35siRNA、IL-12p40siRNA重組腺病毒載體分別感染樹突狀細(xì)胞后，干擾了IL-12p35亞基mRNA和IL-12p40亞基mRNA的表達(dá)，但是只有IL-12p35siRNA重組腺病毒載體感染DC上清中IL-12p70明顯減少，其表面標(biāo)志物(CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ類分子)明顯減少，同時引起了IL-10m

6、RNA的表達(dá)和IL-10水平的升高，在混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中引起的淋巴細(xì)胞增值能力最低，并導(dǎo)致混合培養(yǎng)上清中IL-4的上升和IFN-γ的下降。接受Ad-IL-12p35siRNA感染DC回輸?shù)氖苷咭浦残呐K存活期較陰性對照組、未轉(zhuǎn)染組顯著延長，并且顯著抑制了TH1細(xì)胞因子的產(chǎn)生。 結(jié)論：從骨髓中培養(yǎng)所得細(xì)胞的形態(tài)和功能符合DC，用LPS刺激可以獲得成熟DC。成功構(gòu)建帶有IL-12p35siRNAcDNA，IL-12p40siRNAcD

7、NA的重組腺病毒載體，所攜帶的IL-12p35siRNA，IL-12p40siRNA載體能夠轉(zhuǎn)染小鼠DC并干擾其在DC中表達(dá)。IL-12p35亞基特異性siRNA能夠成功阻止IL-12mRNA的表達(dá)，降低了具有生物活性IL-12p70的濃度，提高IL-10的濃度，抑制CD11c、CD80、CD86和MHCⅡ類分子的表達(dá)，從而抑制DC的共刺激活動，導(dǎo)致在體外TH2偏移。Ad-IL-12p35siRNA處理的DC能夠誘導(dǎo)針對移植供者的特異性