IL-12p35沉默的樹突狀細(xì)胞延長大鼠移植小腸的存活時(shí)間.pdf

1、第本研究分為五部分： 第一章 大鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增與鑒定 目的：探討體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增大鼠樹突狀細(xì)胞(DC)的方法，獲得大量高純度的樹突狀細(xì)胞，并從形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)表型等方面給予鑒定。 方法：采用改良的Son培養(yǎng)方法，梯度離心提取骨髓單核細(xì)胞中的非粘附細(xì)胞，加入GM-CSF 5ng/ml、IL-4 5ng/ml進(jìn)行誘導(dǎo)擴(kuò)增，用顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，電鏡觀察，流式細(xì)胞學(xué)檢測細(xì)胞表面分子，以及功能學(xué)鑒定。

2、 結(jié)果：DC前體細(xì)胞培養(yǎng)7d呈典型樹突狀結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面均表達(dá)MHC Ⅱ、OX62和CD80。培養(yǎng)所得DC具有誘發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的能力，且成熟的DC誘發(fā)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)更強(qiáng)。 結(jié)論：改良的Son法為體外誘導(dǎo)擴(kuò)增大鼠骨髓來源．DC的有效方法。 第二章 IL-12 p35沉默對大鼠骨髓源性DC免疫功能的影響 目的:研究IL-12 p35 siRNA干涉對大鼠髓源性樹突狀細(xì)胞(DC)免疫功能的影響

3、。 方法：通過粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞型集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4和脂多糖(LPS)體外培養(yǎng)體系，從大鼠骨髓中獲得DC，化學(xué)合成小型干擾RNA(siRNA)，體外轉(zhuǎn)染DC。DC細(xì)胞表面分子CD80和MHC Ⅱ表達(dá)采用流式細(xì)胞儀分析，檢測IL-12 p35轉(zhuǎn)錄采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，檢測IL-12、IL-10分泌采用ELISA法，細(xì)胞免疫學(xué)功能采用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)檢測。 結(jié)果：IL-12

4、p35 siRNA轉(zhuǎn)染后的DC表面分子CD80和MHC Ⅱ表達(dá)無明顯改變，分泌IL-12減少、分泌IL-10增多，刺激同種T淋巴細(xì)胞增殖的能力下降。 結(jié)論：IL-12 p35 siRNA的轉(zhuǎn)染不能干擾DC的成熟，但可以抑制其免疫應(yīng)答功能。 第三章IL-12 p35沉默的DC通過T細(xì)胞JAK-STAT途徑阻斷 IL-12信號(hào)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng) 目的：研究IL-12 p35沉默的DC是否通過JAK-STAT途徑阻斷IL-1

5、2信號(hào)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性。 方法:在DC與同種T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)30min后，檢測T淋巴細(xì)胞 STAT3、STAT4、JAK2和TYK2酪氨酸磷酸化水平。 結(jié)果:IL-12未沉默的DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，STAT3、STAT4、JAK2和TYK2酪氨酸磷酸化明顯增加、IL-12 p35沉默DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，STAT3、STAT4、JAK2和TYK2酪氨酸磷酸化水平明顯低于IL-12未沉默的DC。 結(jié)論:

6、IL-12 p35沉默的DC可能是通過的JAK-STAT途徑阻斷T淋巴細(xì)胞激活。 第四章 大鼠小腸移植模型的建立 目的:建立穩(wěn)定的大鼠節(jié)段性小腸移植模型。 方法:選用封閉群SD大鼠進(jìn)行同種異體節(jié)段性小腸移植。帶腸系膜上動(dòng)脈的腹主動(dòng)脈和受體腎下腹主動(dòng)脈端側(cè)吻合，供體門靜脈和受體腎下下腔靜脈端側(cè)吻合。腸道重建：將供腸近端閉合，遠(yuǎn)端施出腹壁造瘺。 結(jié)果:進(jìn)行了45次正式實(shí)驗(yàn)，6只于術(shù)后5天內(nèi)死亡，死亡原因?yàn)榈脱?/p>

7、容量性休克3只，靜脈吻合口狹窄或血栓形成2只，造瘺口回縮1只。其余39只存活超過5天，占86.7％。最長存活超過120天。供體平均手術(shù)時(shí)間(60±10)min，受體平均手術(shù)時(shí)間為(90±15)min，其中動(dòng)脈吻合(10±3)min，靜脈吻合(15±5)min。移植腸熱缺血時(shí)間(28±5)min，冷缺血時(shí)間(25±5)min以內(nèi)。整個(gè)手術(shù)時(shí)間為(150±20)min。 結(jié)論:該種小腸移植手術(shù)方法成功率高，為小腸移植實(shí)驗(yàn)研究提供了穩(wěn)

8、定的模型。 第五章 IL-12 p35 siRNA轉(zhuǎn)染的DC延長大鼠移植小腸存活時(shí)間 目的:探討IL-12 p35 siRNA轉(zhuǎn)染的供者樹突狀細(xì)胞(DC)延長大鼠移植小腸存活時(shí)間的作用。 方法:大鼠隨機(jī)分為5組，每組8對，Wistar大鼠的小腸移植入SD大鼠。組Ⅰ：對照組，受體小腸移植術(shù)前7天腹腔注射生理鹽水；組Ⅱ：移植前7天受體經(jīng)腹腔注射未轉(zhuǎn)染的供體DC；組Ⅲ：移植前7天受體經(jīng)腹腔注射IL-12 p35 siR

9、NA轉(zhuǎn)染的供體DC。組IV：移植前7天受體經(jīng)腹腔注射IL-12 p35 siRNA轉(zhuǎn)染的供體DC，受體大鼠移植術(shù)后當(dāng)天靜脈注射CsA 8 mg/kg/d；組V：移植前7天受體經(jīng)腹腔注射IL-12 p35 siRNA轉(zhuǎn)染的供體DC，受體大鼠移植術(shù)后當(dāng)天靜脈注射CsA 20 mg/kg/d。觀察受鼠移植小腸的存活時(shí)間，對移植小腸進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)檢測受鼠血清白細(xì)胞介素2(IL-2)、γ干擾素(INF-γ)