內(nèi)皮祖細(xì)胞灌注供心誘導(dǎo)免疫耐受延長同種異體心臟移植物存活時(shí)間.pdf

1、第一部分大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定的實(shí)驗(yàn)研究 【目的】研究大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)分離、培養(yǎng)并向內(nèi)皮細(xì)胞方向誘導(dǎo)分化的方法和條件。 【方法】獲取SD大鼠的骨髓細(xì)胞，通過密度梯度離心法分離培養(yǎng)單個(gè)核細(xì)胞，取貼壁細(xì)胞選擇性誘導(dǎo)培養(yǎng)2w以上，獲取內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)。以Dil-ac-LDL、FITC-IYEA-1雙熒光染色法鑒定EPC。 【結(jié)果】貼壁細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后3d開始伸展，5d形成集落，7-10d增殖加

2、速并出現(xiàn)條索狀結(jié)構(gòu)，2w大部分細(xì)胞呈多角形。Dil-ac-LDL、FITC-IYEA-1雙染，免疫熒光染色陽性率大于70％。 【結(jié)論】通過貼壁誘導(dǎo)篩選法培養(yǎng)可以從大鼠骨髓中分離培養(yǎng)出純度較高的具備內(nèi)皮細(xì)胞部分特征的EPC。 第二部分內(nèi)皮祖細(xì)胞的混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 【目的】研究骨髓來源內(nèi)皮祖細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響【方法】以SD大鼠的脾淋巴細(xì)胞為刺激細(xì)胞，以Wistar大鼠的脾淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，

3、分為5組。組I：為對(duì)照組，1x10<'5>個(gè)刺激細(xì)胞和1x10<'5>個(gè)反應(yīng)細(xì)胞共同培養(yǎng)；組II：1x10<'5>個(gè)反應(yīng)細(xì)胞與1×10<'4>個(gè)SD大鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞共同培養(yǎng)；組III：1x10<'5>個(gè)刺激細(xì)胞和1x10<'5>個(gè)反應(yīng)細(xì)胞并加入1×10<'4>個(gè)SD大鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞共同培養(yǎng)；組Ⅳ：1×10<'5>刺激細(xì)胞和1x10<'5>反應(yīng)細(xì)胞并加入1×10<'3>個(gè)SD大鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞共同培養(yǎng)；組V：1×10<'5>刺激細(xì)胞、1 x

4、10<'5>反應(yīng)細(xì)胞、1×10<'4>個(gè)SD大鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞和2μg/ml植物刺激素共同培養(yǎng)。混合培養(yǎng)120小時(shí)，結(jié)束培養(yǎng)前13小時(shí)，每孔加入<'3>H-TdR20ul，以液閃測定儀測定各組的CPM值。 【結(jié)果】各組的CPM值：組Ⅰ為11970.2±2202.2，組Ⅱ?yàn)?279.24±159.8，組Ⅲ為1194.6±362.3，組Ⅳ為1784.44±568.08，組Ⅴ為4839.24±1328.2。組Ⅱ、組Ⅲ、組Ⅳ、組Ⅴ與組Ⅰ相

5、比差異顯著(P<0.05)，組Ⅱ、組Ⅲ、組Ⅳ與組Ⅴ相比差異顯著(P<0.05)。組Ⅱ、組Ⅲ和組Ⅳ組間差異不顯著(P<0.05)。 【結(jié)論】內(nèi)皮祖細(xì)胞在體外共培養(yǎng)能抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，具有抑制細(xì)胞免疫功能。 第三部分同種異體大鼠異位心臟移植模型的建立 【目的】以改良Ono法進(jìn)行大鼠腹部心臟移植，建立動(dòng)物模型。 【方法】以30只體重200～250g的雄性SD大鼠為供體，30只體重200～250g的雌性Wis

6、tar大鼠為受體，進(jìn)行大鼠腹部異位心臟移植手術(shù)。SD大鼠經(jīng)麻醉、肝素化后，打開胸腔，阻斷主動(dòng)脈，經(jīng)主動(dòng)脈根部灌注心肌保護(hù)液，將供體的心臟取下。Wistar大鼠麻醉后，打開腹腔，將供體的主動(dòng)脈與受體的腹主動(dòng)脈行端側(cè)吻合，將供體的肺動(dòng)脈和受體的下腔靜脈行端側(cè)吻合。觀察術(shù)后供心的生存時(shí)間。 【結(jié)果】大鼠異位心臟移植模型成功率達(dá)90％。術(shù)后平均供心存活時(shí)間為6.74±1.1d。 【結(jié)論】改良Ono法進(jìn)行大鼠腹部心臟移植模型可靠易

7、行，可重復(fù)率高。 第四部分內(nèi)皮祖細(xì)胞灌注供心的安全性評(píng)價(jià) 【目的】評(píng)價(jià)同種異體大鼠心臟移植手術(shù)中EPC灌注供心的安全性。 【方法】以15只體重200～250g的雄性SD大鼠為供體，15只體重200～250g的雌性Wistar大鼠為受體，分為3組，每組5對(duì)。組I：供心移植前經(jīng)冠脈灌注DAPI染色的1×10<'7>個(gè)SD大鼠的骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)；組Ⅱ：供心移植前經(jīng)冠脈灌注DAPI染色的1×10<'6>個(gè)S

8、D大鼠的EPC；組Ⅲ：供心移植前經(jīng)冠脈灌注DAPI染色的1×10<'5>個(gè)SD大鼠的EPC。進(jìn)行異位心臟移植術(shù)，觀察術(shù)中、術(shù)后心律失常發(fā)生，圍手術(shù)期心臟停跳、心肌梗死的發(fā)生率；術(shù)后5天取移植心，通過冰凍切片熒光顯微鏡觀察灌注內(nèi)皮祖細(xì)胞心肌內(nèi)分布。 【結(jié)果】組I術(shù)后心律失常發(fā)生率60％(3/5)，出現(xiàn)供心早期的停跳40％(2/5)，復(fù)旦大學(xué)博士論文·2007病理標(biāo)本發(fā)現(xiàn)心肌梗死40％(2/5)，在組Ⅱ和組Ⅲ未見發(fā)生，組Ⅰ和組Ⅱ、Ⅲ

9、相比，差異有顯著性(P<0.05)。平均熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)：組Ⅰ為4.734±0.69個(gè)/mm<'2>，組Ⅱ?yàn)?.58±0.62個(gè)/mm<'2>，組Ⅲ為1.11±0.24個(gè)/mm<'2>，組Ⅲ比組Ⅰ、Ⅱ明顯減少，差異有顯著性(P<0.05)。 【結(jié)論】以細(xì)胞數(shù)量為1×10<'6>個(gè)內(nèi)皮祖細(xì)胞灌注供心是安全的。 第五部分內(nèi)皮祖細(xì)胞灌注對(duì)同種異體心臟移植供心生存時(shí)間的影響 [目的] 研究EPC灌注供心對(duì)同種異體心臟移植物生存

10、時(shí)間的影響。 [方法] 20只體重200～250g的雄性SD大鼠為供體，20只體重200～250g的雌性Wistar大鼠為受體，分為4組，每組5對(duì)。組Ⅰ：為對(duì)照組，術(shù)后不使用環(huán)胞霉素；組Ⅱ：術(shù)后7天每天使用環(huán)胞霉素5mg/kg；組Ⅲ：術(shù)中供心經(jīng)冠脈灌注內(nèi)皮祖細(xì)胞1×10<'6>個(gè)，術(shù)后不使用環(huán)胞霉素；組Ⅳ：術(shù)中供心經(jīng)冠脈灌注內(nèi)皮祖細(xì)胞1×10<'6>個(gè)，術(shù)后7天每天使用環(huán)胞霉素5mg/kg。觀察各組供心存活時(shí)間，供心跳動(dòng)變?nèi)鯐r(shí)取

11、出移植物，進(jìn)行病理檢查。 [結(jié)果] 各組供心平均存活時(shí)間分別為：組Ⅰ為6.24±0.8d，組Ⅱ?yàn)?1.6±1.1d，組Ⅲ為9.44±1.1d，組Ⅳ為18.8±1.6d。組Ⅱ、組Ⅳ移植物的平均存活時(shí)間較組Ⅰ顯著延長(P<0.05)。組Ⅳ移植心臟平均存活時(shí)間明顯長于組Ⅱ和組Ⅲ(P<0.05)。 [結(jié)論]內(nèi)皮祖細(xì)胞灌注合并環(huán)胞霉素運(yùn)用可以延長大鼠心臟移植物的存活時(shí)間。 第六部分內(nèi)皮祖細(xì)胞灌注對(duì)同種異體大鼠心臟移植急性排

12、斥反應(yīng)的影響 [目的]通過遠(yuǎn)交系和近交系大鼠異位心臟移植的比較，根據(jù)術(shù)后近期的脾臟和淋巴結(jié)中CD3<'+>、CD4<'+>和CD8<'+>的增生情況，了解同種異體大鼠心臟移植術(shù)后T細(xì)胞免疫的變化，結(jié)合術(shù)后的移植心的病理檢查研究EPC灌注對(duì)心臟移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的影響。 [方法]10只體重200～250g的雌性Wistar大鼠，隨機(jī)分為供體和受體，共5對(duì)，為組Ⅰ(近交系移植組)；另外20只體重200～250g的雄性SD大

13、鼠為供體，20只體重200～250g的雌性Wistar大鼠為受體，分為4組，每組5對(duì)：組Ⅱ術(shù)后不使用環(huán)胞霉素，組Ⅲ術(shù)后7天每天使用環(huán)胞霉素5mg/kg，組Ⅳ術(shù)中供心經(jīng)冠脈灌注內(nèi)皮祖細(xì)胞1×10<'6>個(gè)，組Ⅴ術(shù)中供心經(jīng)冠脈灌注內(nèi)皮祖細(xì)胞1×10<'6>個(gè)、術(shù)后7天每天使用環(huán)胞霉素5mg/Kg。術(shù)后七天取供心，觀察病理改變，并取脾臟和腹股溝淋巴結(jié)通過流式細(xì)胞測定CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>的百分比，計(jì)算并比較各組CD4<

14、'+>/CD8<'+>的比值。 [結(jié)論]內(nèi)皮祖細(xì)胞合并環(huán)胞霉素的運(yùn)用能調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞CD4/CD8比例，改善急性排斥反應(yīng)，具有一定的誘導(dǎo)免疫耐受功能。 第七部分供體內(nèi)皮祖細(xì)胞灌注供心對(duì)同種異體大鼠心臟移植細(xì)胞因子的影響 [目的]通過研究心肌組織的細(xì)胞因子的含量變化，探討供體內(nèi)皮祖細(xì)胞灌注供心改善急性排斥反應(yīng)的機(jī)理。 [方法]以20只體重200～250g的雄性SD大鼠為供體，20只體重200～250g的雌性W

15、istar大鼠為受體，分為4組，每組5對(duì)：組Ⅰ為對(duì)照組，術(shù)后不使用環(huán)胞霉素；組Ⅱ術(shù)后7天每天使用環(huán)胞霉素5mg/kg；組Ⅲ術(shù)中供心經(jīng)冠脈灌注內(nèi)皮祖細(xì)胞1×10<'6>個(gè)；組Ⅳ術(shù)中供心經(jīng)冠脈灌注內(nèi)皮祖細(xì)胞1×10<'6>個(gè)，術(shù)后7天每天使用環(huán)胞霉素5mg/Kg。各組于術(shù)后第7天取供心，使用實(shí)時(shí)定量PCR的方法測定各組移植心INF-γ、IL-2、TNF-α，TGF-β、VEGF、IL-10的含量。 [結(jié)果]心肌細(xì)胞因子的檢查：與組Ⅰ

16、相比，組Ⅱ、組Ⅲ和組Ⅳ的INF-γ、IL-2細(xì)胞因子明顯降低并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0．05)，IL-10改變無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，組Ⅱ、組Ⅲ的TGF-β升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，組Ⅱ、組Ⅲ和組Ⅳ的TNF-α較組Ⅰ明顯降低并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與組Ⅰ相比，組Ⅲ的VEGF表達(dá)明顯最多有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，組Ⅳ的VEGF表達(dá)降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，組Ⅱ的VEGF表達(dá)與組I相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05