胸腺修飾誘導(dǎo)豬同種心臟移植免疫耐受及期間細(xì)胞流變學(xué)特性變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景及目的：經(jīng)過多年基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)，同種原位心臟移植已成為一種應(yīng)用于臨床治療終末期心臟病的有效方法。目前，供心保存、外科手術(shù)技術(shù)、術(shù)后感染已不再是阻礙心臟移植成功的最主要因素。但心臟移植術(shù)后的排斥反應(yīng)、長期應(yīng)用免疫抑制劑所引起的并發(fā)癥及昂貴的醫(yī)療費(fèi)用都是亟待解決的問題。同時(shí)，同種異基因器官供體遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需求量。異種移植有可能解決這一矛盾，但目前的免疫抑制方案仍不足以阻止異種器官的排斥，單純?cè)黾用庖咭种苿┑膭┝坎豢赡鼙ＷC成功的

2、異種移植。因此，如何有效地誘導(dǎo)供體特異性的免疫耐受便成為解決上述問題的關(guān)鍵。 胸腺修飾這一誘導(dǎo)方法已經(jīng)在大鼠的心臟移植、腎移植以及胰腺移植研究中獲得很大進(jìn)展。然而，很多實(shí)驗(yàn)觀察到即使成功誘導(dǎo)免疫耐受，還是會(huì)出現(xiàn)一定程度的排斥反應(yīng)，有學(xué)者認(rèn)為這種現(xiàn)象可能與受體照射或藥物處理后殘存體內(nèi)的淋巴細(xì)胞有關(guān)，如何清除這些細(xì)胞可能是誘導(dǎo)免疫耐受的關(guān)鍵。 同時(shí)，這一研究領(lǐng)域中，有關(guān)大動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)報(bào)道甚少，對(duì)于動(dòng)物免疫耐受誘導(dǎo)的研究較多，但

3、嚙齒類動(dòng)物血管內(nèi)皮不表達(dá)MHC類抗原，其同種急性排斥反應(yīng)的機(jī)制與人類有很大不同，其程度也相對(duì)較輕。并且，從臨床應(yīng)用前景考慮，大動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究也應(yīng)受到更多的重視。許多研究表明，在同種心臟移植排斥反應(yīng)過程中可見紅、白細(xì)胞聚集于心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍，血管內(nèi)大量紅細(xì)胞聚集，白細(xì)胞和血小板附壁，血管腔隙變窄堵塞等微循環(huán)障礙。這些現(xiàn)象提示紅細(xì)胞、白細(xì)胞流變學(xué)特性改變是與同種移植排斥反應(yīng)及移植物失功相伴隨的關(guān)鍵因素之一。而細(xì)胞流變學(xué)在急性排

4、斥反應(yīng)期間扮演的確切角色及其發(fā)生機(jī)制目前尚不清楚。 因此，本實(shí)驗(yàn)選擇豬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，先用X線照射破壞受體的免疫系統(tǒng)，然后采用胸腺注入供體脾細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受，并于稍后靜脈輸注供體淋巴細(xì)胞刺激受體殘存淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡，再行異位心臟移植，觀察移植心存活時(shí)間，檢測(cè)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，來確定免疫耐受是否發(fā)生及其程度，探尋大動(dòng)物免疫耐受模型的誘導(dǎo)方式，為進(jìn)一步的異種心臟移植研究打下基礎(chǔ)。并觀察這一期間紅、白細(xì)胞流變學(xué)特性的改變及其變化規(guī)律，進(jìn)

5、一步探討和驗(yàn)證其與急性排斥反應(yīng)的關(guān)系。 課題研究分為以下三個(gè)部分： 第一部分：建立豬腹部心臟移植動(dòng)物模型方法： 1．分組：供體，三元雜豬28只；受體，二元雜豬28只。共進(jìn)行移植手術(shù)28例，其中正式實(shí)驗(yàn)23例，預(yù)實(shí)驗(yàn)5例。 2．動(dòng)物模型制作：以O(shè)no術(shù)式為基礎(chǔ)，局部加以改進(jìn)，將供心的升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈分別與受體的腹主動(dòng)脈和下腔靜脈行端側(cè)吻合，制作豬腹腔同種異位心臟移植模型。 結(jié)果： 預(yù)實(shí)驗(yàn)5例

6、，移植心存活超過3天的有2例。其他3例具體情況如下：術(shù)中受體追加麻藥過量死亡1例；血管吻合開放后心臟不復(fù)跳2例。 正式實(shí)驗(yàn)23例，其中20例移植心均存活3天以上；有2例移植心未復(fù)跳；1例術(shù)后出血，于移植術(shù)后第1天死亡。 第二部分：胸腺修飾誘導(dǎo)豬心臟移植免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究方法： 1．分組 共分四組，每組供受體各5頭： 空白組一受體不作任何處理，接受心臟移植； 對(duì)照組一受體接受2Gy劑量X線全

7、身照射后2周行心臟移植； 實(shí)驗(yàn)A組一受體接受2Gy劑量X線全身照射的當(dāng)天，進(jìn)行胸腺內(nèi)注射供體脾細(xì)胞，2周后行心臟移植； 實(shí)驗(yàn)B組一受體接受2Gy劑量X線全身照射的當(dāng)天，進(jìn)行胸腺內(nèi)注射供體脾細(xì)胞，1周后靜脈注射供體淋巴細(xì)胞，2周后行心臟移植。 2．照射后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不良反應(yīng)的觀察。 3．照射后受體淋巴細(xì)胞總數(shù)的變化。于受體豬接受照射前1天，照射后第1、3、7和14天檢測(cè)淋巴細(xì)胞總數(shù)。 4．移植心存活時(shí)間

8、的觀察。 5．混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的檢測(cè)。 于受體豬接受照射前1天，照射后第1周和第2周分別采供體靜脈血2ml、受體靜脈血2ml，行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)其刺激效應(yīng)。 6病理學(xué)檢查：心臟停跳后切取部分心肌，進(jìn)行心肌組織病理學(xué)檢查，并進(jìn)行排斥反應(yīng)病理分級(jí)。7．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用One-Way ANOVA、重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析檢驗(yàn)方法。P<0

9、.05為存在顯著性差異。 結(jié)果： 1．照射后不良反應(yīng)觀察對(duì)照組照射后2例出現(xiàn)嘔吐，1例出現(xiàn)拒食；實(shí)驗(yàn)A組1例嘔吐，1例拒食；實(shí)驗(yàn)B組1例嘔吐，1例耳后出現(xiàn)淤斑。 2．照射前后淋巴細(xì)胞總數(shù)的變化各組照射后第2天淋巴細(xì)胞總數(shù)最低，2周后恢復(fù)至照射前的30％～40％。 3．移植心存活時(shí)間空白組平均存活4.2天，對(duì)照組平均存活4.6天，實(shí)驗(yàn)A組平均存活7.6天，實(shí)驗(yàn)B平均存活9.6天?？瞻捉M與對(duì)照組移植心存活時(shí)間

10、無顯著差異，實(shí)驗(yàn)A組與空白組及對(duì)照組比較均有顯著性差異(分別為P=0.001，P=0.003)，實(shí)驗(yàn)B組與空白組及對(duì)照組比較同樣有顯著性差異(P=0.000)，實(shí)驗(yàn)A組與實(shí)驗(yàn)B組差異具有顯著性意義(P=0.036)。 4．MLR檢測(cè)同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，在照射前及預(yù)處理后1周各組間均無顯著性差異(P>0.05)；預(yù)處理后2周實(shí)驗(yàn)A組及實(shí)驗(yàn)B組較對(duì)照組均有顯著性差異(P=0.000)，實(shí)驗(yàn)A組與實(shí)驗(yàn)B組之間的差異亦存在顯著性意義(P=0.

11、002)。重復(fù)測(cè)量統(tǒng)計(jì)，組間效應(yīng)比較說明預(yù)處理方法的不同對(duì)淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響有顯著性意義(F=6.065，P=0.015)；各時(shí)間點(diǎn)與預(yù)處理方法存在交互效應(yīng)(F=13.039，P=0.001)，重復(fù)因素各時(shí)間點(diǎn)間存在顯著性差異(113.897，P=0.000)；多重比較說明單純照射(對(duì)照組)后各時(shí)間點(diǎn)MLR無顯著性差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)A組(P<0.05)及實(shí)驗(yàn)B組(P=0.000)預(yù)處理后2周較照射前MLR均有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)B組

12、預(yù)處理后2周較預(yù)處理后1周MLR之間的差異有顯著性意義(P=0.000)。5．移植心病理學(xué)檢查停跳后各組移植心病理學(xué)檢查均為4級(jí)排斥反應(yīng)。 結(jié)論： 1、胸腺修飾抗原量采用供體脾細(xì)胞10×10<'7>個(gè)/kg達(dá)到了一定效果。 2、2Gy低劑量X射線照射對(duì)受體外周淋巴細(xì)胞的清除是有效的。 3、單純X射線照射無法誘導(dǎo)有效的移植免疫耐受。 4、受體豬全身照射后單純胸腺修飾可誘導(dǎo)一定程度的免疫抑制。

13、 5、受體豬全身照射后，胸腺修飾聯(lián)合靜脈注射供體淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫抑制程度較單純胸腺修飾進(jìn)一步加深，但并未誘導(dǎo)出小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)出的“永久性”免疫耐受。 第三部分：免疫耐受誘導(dǎo)期間細(xì)胞流變學(xué)特性的改變方法： 1．分組：同第二部分。 2．標(biāo)本采集：在受體豬照射前1天、照射后第1、7、14天及移植術(shù)后1、3、5、7、9天抽取靜脈血6ml檢測(cè)。 3．紅、白細(xì)胞流變學(xué)特性檢測(cè)：測(cè)定紅細(xì)胞聚集指數(shù)(erythrocy

14、te aggregation index，EAI)、紅細(xì)胞變形指數(shù)(erythrocyte deformability index，EDI)及白細(xì)胞變形指數(shù)(leucocyte deformability index，LDI)。 4．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義界限。各組流變學(xué)參數(shù)行重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析并行多重比較(LSD檢驗(yàn))。結(jié)果： 1．空白組及對(duì)照組在術(shù)前各時(shí)間點(diǎn)

15、與照射前無顯著差異，術(shù)后早期即出現(xiàn)紅細(xì)胞聚集指數(shù)持續(xù)升高，紅、白細(xì)胞變形性則持續(xù)下降； 2．實(shí)驗(yàn)A組細(xì)胞流變學(xué)特性開始顯著惡化則發(fā)生在術(shù)后第5天； 3．實(shí)驗(yàn)B組則進(jìn)一步延后，在術(shù)后第9天紅細(xì)胞聚集性升高，細(xì)胞變形性顯著下降。 結(jié)論： 1、在豬同種心臟移植急性排斥反應(yīng)期間，紅細(xì)胞聚集性持續(xù)升高、紅白細(xì)胞變形性持續(xù)下降。 2、X射線照射可引起早期白細(xì)胞變形性的下降，但持續(xù)時(shí)間較短。對(duì)紅細(xì)胞聚集性及變形