供者細(xì)胞脾內(nèi)移植誘導(dǎo)小鼠氣管移植耐受.pdf

1、肺移植是治療終末期肺病唯一有效的方法，但目前面臨困境，免疫抑制效果尚顯不足，免疫治療相關(guān)并發(fā)癥已十分嚴(yán)重，移植物排斥和免疫治療相關(guān)疾病嚴(yán)重影響了肺移植受者的長(zhǎng)期生存。繼續(xù)加強(qiáng)非特異性免疫抑制可能對(duì)改善總體結(jié)果無(wú)益。 誘導(dǎo)移植耐受，即供者特異性免疫耐受，是目前最有希望的解困之道。存骨髓移植(BMT)和供者特異性輸注(DST)這兩個(gè)耐受現(xiàn)象的啟發(fā)下，含BMT方案和含DST逐漸發(fā)展成為移植耐受研究領(lǐng)域的兩類經(jīng)典誘導(dǎo)方案。2008年一個(gè)

2、令人振奮的腎移植臨床試驗(yàn)報(bào)告稱，在5例受者中有4例經(jīng)含BMT方案成功誘導(dǎo)出移植耐受。然而，輻照副反應(yīng)和/或移植物抗宿主反應(yīng)(GVHR)風(fēng)險(xiǎn)仍是含BMT方案、含DST方案應(yīng)用于臨床器官移植的重大阻礙，尤其是對(duì)于那些終末期肺病患者。在過(guò)去十年，隨著共刺激阻滯藥物和新型免疫抑制劑的出現(xiàn)，非特異性免疫抑制被進(jìn)一步加強(qiáng)，但誘導(dǎo)供者特異性耐受的研究進(jìn)展不大。 模仿其他耐受現(xiàn)象可能是研究供者特異性耐受誘導(dǎo)的另外一個(gè)突破口。除了BMT、DST相

3、關(guān)耐受外，另外還有兩個(gè)已知的耐受現(xiàn)象，也就是自發(fā)肝移植耐受和多器官移植的免疫特惠現(xiàn)象。已經(jīng)明確，在嚙齒類動(dòng)物模型中，肝、脾或胸腺的異體移植物可為同期或后續(xù)的同一供者來(lái)源的其他器官移植物提供免疫保護(hù)。由于操作復(fù)雜、創(chuàng)傷大，把聯(lián)合多器官移植開(kāi)發(fā)成為像含BMT方案或含DST方案那樣的耐受誘導(dǎo)方案幾乎是不可能的。 移植領(lǐng)域近期一個(gè)新進(jìn)展是，肝細(xì)胞移植可取代實(shí)體肝移植治療某些急性肝衰竭。在小鼠模型，肝細(xì)胞移植是通過(guò)脾內(nèi)注射供者肝臟細(xì)胞來(lái)完

4、成的。除了肝臟，脾臟和胸腺都可制成單個(gè)細(xì)胞懸液。因此，用細(xì)胞移植取代脾、胸腺實(shí)體器官移植也是有可能的。 本研究擬通過(guò)細(xì)胞移植來(lái)復(fù)制肝、脾和胸腺實(shí)體器官移植對(duì)小鼠異位氣管移植物的免疫保護(hù)作用。 第一部分：脾內(nèi)細(xì)胞移植取代臟器移植誘導(dǎo)小鼠氣管移植物耐受的可行性研究 目的：研究脾內(nèi)細(xì)胞移植取代臟器移植誘導(dǎo)小鼠氣管移植物耐受的可行性 材料與方法：供者為6～8周齡健康雄性BALB/c(H-2d)小鼠，受者為6～8周

5、齡健康雌性C578L/6(H-2b)小鼠。所有受者術(shù)前1d接受60Coγ射線全身輻照(TBI：5.5Gy)，手術(shù)當(dāng)天接受氣管異位移植和細(xì)胞移植。除了對(duì)照組(Con)外，200μl的5×106骨髓細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入。5.5B、5.5BS、5.5BT、5.5BH組受者分別接受脾內(nèi)注射PBS(100μl)、脾細(xì)胞(1×107/100μl)、胸腺細(xì)胞(1×107/100μl)、或者肝臟細(xì)胞(1×107/100μl)。在術(shù)后1、3、5、7周流式細(xì)胞

6、儀檢測(cè)外周血單核細(xì)胞的混合嵌合。監(jiān)測(cè)GVHR，直到受者死亡或者8周的觀察期到期。所有死于GVHR的受者做尸檢。組織學(xué)檢查氣管移植物、脾、肝和肺。 結(jié)果：在5.5BS、5.5BT組的受者檢測(cè)到供者巨嵌合(＞1％)，第1周末時(shí)分別為54.3±13.1％和47.6±3：17.1％，但到7周末時(shí)很快降到9.9±7.0％和5.8±7.6％。這兩組受者在7周之后出現(xiàn)嚴(yán)重的GVHR，死亡率高達(dá)50％和60％。5.5B、5.5BH、Con組未出

7、現(xiàn)嵌合，沒(méi)有GVHR，也沒(méi)有死亡。7周時(shí)氣管管腔在5.5B、5.5BH、Con組均已完全閉塞，而在5.5BS、5.5BT組閉塞25％。 結(jié)論：脾內(nèi)細(xì)胞移植可以取代脾、胸腺的實(shí)體臟器移植，誘導(dǎo)小鼠異位氣管移植模型的移植耐受。這種移植后初期形成的免疫穩(wěn)態(tài)很脆弱，在沒(méi)有免疫抑制保護(hù)下迅速瓦解。脾內(nèi)肝細(xì)胞移植技術(shù)上可行，但不能發(fā)揮類似于實(shí)體肝移植物的免疫侏護(hù)作用。 第二部分：脾內(nèi)注射與其他細(xì)胞移植途徑的比較研究 目的：確

8、定脾內(nèi)、胸腺內(nèi)、靜脈內(nèi)細(xì)胞移植三種途徑中哪一種最佳。 材料與方法：供者為6～8周齡健康雄性BALB/c(H-2d)小鼠，受者為6～8周齡健康雌性C57BL/6(H-2b)小鼠。所有受者術(shù)前1d接受60Coγ射線全身輻照(TBI：5.5 Gy)，手術(shù)當(dāng)天接受氣管異位移植和細(xì)胞移植。除了對(duì)照組(Con)外，200μl的5×106骨髓細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入。5.5BT和5.5BBs組受者分別接受脾內(nèi)注射胸腺細(xì)胞(1×107/100μl)、未

9、分類的骨髓細(xì)胞(1×107/100μl)。5.5BTt組受者接受胸腺內(nèi)注射胸腺細(xì)胞(每葉一半，總計(jì)1×107/100μl)。5.5BB組受者接受額外劑量(1×107/100μl)的尾靜脈內(nèi)骨髓移植。在術(shù)后1、3、5、7周流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單核細(xì)胞的混合嵌合。監(jiān)測(cè)GVHR，直到受者死亡或者8周的觀察期到期。所有死于GVHR的受者做尸檢。組織學(xué)檢查氣管移植物、脾、肝和肺。 結(jié)果：在5.5BT、5.5BTt和5.5BBs組的受者檢測(cè)

10、到供者巨嵌合(＞1％)，第1周末時(shí)分別為47.6±17.1％、40.1±8.3％和33.2±11.5％，但到7周末時(shí)很快降到5.8±7.6％、0.06±0.03和0.08±0.02％。5.5BT組受者在7周之后出現(xiàn)嚴(yán)重的GVHR，死亡率高達(dá)60％。5.5BB和Con組未出現(xiàn)嵌合，沒(méi)有GVHR，也沒(méi)有死亡。7周時(shí)氣管管腔在5.5BTt和5.5BBs幾乎閉鎖、在5.5BB和Con組完全閉塞，而在5.5BT組閉塞僅25％。 結(jié)論：在免

11、疫保護(hù)方面，供者細(xì)胞脾內(nèi)移植優(yōu)于胸腺內(nèi)移植和外周靜脈移植。移植細(xì)胞的免疫反應(yīng)性越大、免疫調(diào)節(jié)作用越好，脾內(nèi)細(xì)胞移植是利用供者免疫反應(yīng)性細(xì)胞誘導(dǎo)耐受的最佳途徑。 第三部分：脾內(nèi)細(xì)胞移植的免疫特惠強(qiáng)度 目的：明確脾內(nèi)細(xì)胞移植的免疫特惠強(qiáng)度。 材料與方法：供者為6～8周齡健康雄性BALB/c(H-2d)小鼠，受者為6～8周齡健康雌性C57BL/6(H-2b)小鼠。所有受者術(shù)前1d接受60Coγ射線全身輻照(TBI：3.

12、0Gy)，手術(shù)當(dāng)天接受氣管異位移植和細(xì)胞移植。除了對(duì)照組(Con)外，200μl的5×106骨髓細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入。3.0B、3.0BS、3.0BT、3.0BST、3.0BSTB和3.0BSTBL組受者分別接受脾內(nèi)注射PBS(100μl)、脾細(xì)胞(1×107/100μl)、胸腺細(xì)胞(1×107/100μl)、脾+胸腺細(xì)胞(總計(jì)1×107/100μl)、脾+胸腺+骨髓細(xì)胞(總計(jì)1×107//100μl)、脾+胸腺+骨髓+外周血單核細(xì)胞(總計(jì)

13、1×107/100μl)。在術(shù)后1、3、5、7周流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血單核細(xì)胞的混合嵌合。監(jiān)測(cè)GVHR，直到受者死亡或者8周的觀察期到期。所有死于GVHR的受者做尸檢。組織學(xué)檢查氣管移植物、脾、肝和肺。 結(jié)果：所有實(shí)驗(yàn)組的受者在第1、3、5、7周末時(shí)均未檢測(cè)到外周血供者巨嵌合，沒(méi)有GVHR，也沒(méi)有死亡。7周時(shí)氣管管腔在所有實(shí)驗(yàn)組均完全閉塞。 結(jié)論：當(dāng)TBI從5.5Gy降到3.0 Gy，BMt(5×106/只)和脾內(nèi)細(xì)胞移植