CopC穩(wěn)定性及其在銅調(diào)控中的作用.pdf

1、CopC是一個銅伴侶蛋白,含有102個氨基酸殘基,分子量大約為10kDa。核磁結(jié)構(gòu)顯示蛋白質(zhì)在溶液中是由9股P折疊片形成的希臘桶狀結(jié)構(gòu)。僅有的一個色氨酸和一個酪氨酸殘基位于疏水桶中。CopC對Cu+和Cu2+都有很高的親和性,Cu2+的結(jié)合位點位于蛋白質(zhì)的N端,由組氨酸殘基His1、His91、Glu27和Asp89構(gòu)成。桶的C端為Cu+結(jié)合位點,由四個甲硫氨酸殘基Met40、Met43、Met46和Met51組成。兩個不同價態(tài)的銅離子

2、相距約30A。
　　芳香族氨基酸如色氨酸(Tip)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)在蛋白質(zhì)進化過程中被認(rèn)為是保守的氨基酸殘基。其側(cè)鏈在蛋白質(zhì)折疊中發(fā)揮非常重要的作用。此外,CopC的疏水桶對生物體內(nèi)銅的轉(zhuǎn)運有重要作用。本文圍繞CopC中的芳香族氨基酸殘基Trp和Tyr及可能會對疏水桶造成影響的氨基酸進行突變,利用定點突變技術(shù)構(gòu)建并得到了十種CopC突變體基因與大腸桿菌表達載體的重組質(zhì)粒(Y79F、Y79W、Y79WW83L、

3、Y79WW83F、V81H、D89G、A85M、Y79T、Y79S、Y79H,其中Y79F、Y79W、Y79WW83L、Y79WW83F由鄭曉艷博士構(gòu)建),并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli)BL21中進行高效表達,經(jīng)陰、陽離子柱純化,電泳、紫外光譜等表征、鑒定,獲得了較高純度的目的蛋白(Y79F、Y79W、Y79WW83L、Y79WW83F、V81H、D89G、A85M)。
　　化學(xué)變性劑引起蛋白質(zhì)去折疊是用于測定蛋白質(zhì)穩(wěn)定

4、性的常用方法,可獲得吉布斯自由能或m(是描述結(jié)構(gòu)基元對變性劑敏感程度)和[D]1/2(50％蛋白質(zhì)由天然態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻庹郫B態(tài)時的變性劑濃度)等參數(shù)。為了更準(zhǔn)確地描述分子量較大的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,本文提出了用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究的結(jié)構(gòu)基元模型。該模型假設(shè)蛋白質(zhì)由結(jié)構(gòu)基元組成,結(jié)構(gòu)基元的解折疊服從“兩態(tài)”機理。結(jié)構(gòu)基元的解折疊自由能通過線性外推法求得。蛋白質(zhì)的解折疊曲線是所有結(jié)構(gòu)基元解折疊曲線的線性疊加。蛋白質(zhì)平均結(jié)構(gòu)基元自由能是所有結(jié)構(gòu)基元自由能

5、的幾率求和。蛋白質(zhì)的解折疊自由能是平均結(jié)構(gòu)基元自由能的n(結(jié)構(gòu)基元數(shù)目)倍。此外,簡介了受控分子動力學(xué)模擬(SMD)方法用于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研宄。
　　為了探測Trp83及Tyr79在維系蛋白質(zhì)疏水桶穩(wěn)定性中所起的作用,本文用熒光光譜、遠(yuǎn)紫外CD光譜、熒光壽命等方法研宄了鹽酸胍及尿素引起的CopC及其突變體(Y79F、Y79W、Y79WW83L、Y79WW83F)的解折疊。并用結(jié)構(gòu)基元模型分析了蛋白質(zhì)的解折疊自由能。數(shù)據(jù)表明,Y79F

6、及Y79W的平均結(jié)構(gòu)基元自由能比apoCopC分別減小6.51和2.03kJ/mol。Y79WW83L與Y79W相比,平均結(jié)構(gòu)基元自由能減小11.44kJ/mol,但Y79WW83F與Y79W相比,平均結(jié)構(gòu)基元自由能增加1.82kJ/mol。結(jié)果表明,突變體的解折疊自由能減小,穩(wěn)定性降低。Trp83及Tyr79在維系apoCopC疏水桶結(jié)構(gòu)中起著至關(guān)重要的作用。其中Tyr79以“Tyrosine Corner”的方式,通過與Thr75形

7、成氫鍵穩(wěn)定蛋白質(zhì)疏水桶結(jié)構(gòu);而處于疏水環(huán)境的Trp83是其芳香基團對蛋白質(zhì)疏水桶的穩(wěn)定起到重要作用。
　　ApoCopC的解折疊曲線表現(xiàn)為“兩態(tài)”,但 Cu2+-CopC及突變體Y79WW83F的解折疊均表現(xiàn)為“三態(tài)”。依據(jù)結(jié)構(gòu)基元模型,三態(tài)解折疊曲線意味著CopC至少含有兩個結(jié)構(gòu)基元。本文用色氨酸的內(nèi)源熒光光譜、遠(yuǎn)紫外CD光譜、TNS、熒光壽命、熒光各向異性測量、SMD模擬等手段研究了SDS及CTAB誘導(dǎo)的CopC的解折疊行為。

8、結(jié)果表明,SDS與CTAB均能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成中間態(tài),這個中間態(tài)只對應(yīng)著一個結(jié)構(gòu)基元的解折疊。而另一個結(jié)構(gòu)基元只有通過尿素或鹽酸胍才能使其解折疊。此外,Cu2+、Ag+對CTAB/SDS誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)及突變體解折疊行為的影響證明,表面活性劑誘導(dǎo)的解折疊的結(jié)構(gòu)基元對應(yīng)著C端,尿素或鹽酸胍誘導(dǎo)的解折疊的另一個結(jié)構(gòu)基元對應(yīng)著N端。因此,推斷中間態(tài)的結(jié)構(gòu)為C端發(fā)生了解折疊,而N端保持完整。
　　為了探索有機小分子在CopC銅氧化還原開關(guān)中的作

9、用,通過紫外差光譜、熒光光譜及熒光壽命等方法研究了銅伴侶蛋白apoCopC與小分子HSSC的相互作用。生理條件下,HSSC可與apoCopC形成1:1的復(fù)合物,主要作用力為范德華力和氫鍵。FRET測定、分子對接軟件Arguslab模擬HSSC的結(jié)合位點位于蛋白質(zhì)的C端。這將可能影響Cu+的結(jié)合性質(zhì),從而影響CopC銅轉(zhuǎn)運功能。
　　為了探究CopC兩端金屬離子結(jié)合性質(zhì)及中央疏水桶對CopC銅調(diào)節(jié)的機制的影響,構(gòu)建了可能會對疏水桶產(chǎn)