白介素18對(duì)胰腺癌免疫治療作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分 IL-18在胰腺癌組織及胰腺癌患者血漿中表達(dá)的檢測(cè)
　　目的：篩選胰腺癌潛在的免疫治療因子，并擴(kuò)大樣本量在胰腺癌組織和胰腺癌患者血漿中進(jìn)行檢測(cè)。
　　方法：采用RayBiotech Human Cytokine Array分析3例胰腺癌及健康對(duì)照血漿中差異表達(dá)的細(xì)胞因子，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)組胰腺癌表達(dá)譜基因芯片數(shù)據(jù)，初步確定研究對(duì)象； E-LISA檢測(cè)104例胰腺癌患者、35例胰腺良性腫瘤患者、27例十二指腸腫瘤患者、77

2、例膽管癌患者、8例肝癌患者、22例胰腺炎患者、38例健康對(duì)照血漿中IL-18的表達(dá)，并分析IL-18表達(dá)量與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系；免疫組織化學(xué)檢測(cè)112例胰腺癌及相應(yīng)癌旁正常胰腺組織中IL-18的表達(dá)，并分析IL-18表達(dá)量與臨床病理、臨床分期以及預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.RayBiotech Human Cytokine Array示差異性表達(dá)細(xì)胞因子23個(gè)，其中胰腺癌患者血漿中高表達(dá)11個(gè)、低表達(dá)12個(gè)，在高表達(dá)的細(xì)

3、胞因子中，IL-18差異最明顯；胰腺癌組織基因芯片數(shù)據(jù)分析顯示 IL-18在胰腺癌與免疫系統(tǒng)的相互作用中可能發(fā)揮重要作用。
　　2.IL-18在胰腺癌患者血漿中的表達(dá)量相對(duì)胰腺良性腫瘤、十二指腸腫瘤、膽管癌、肝癌、胰腺炎患者高表達(dá)；在胰腺癌患者中，手術(shù)前3天IL-18的表達(dá)量要比手術(shù)后3天的高（p＜0.01）；IL-18的表達(dá)量與胰腺癌生存期呈正相關(guān)（p＜0.05）。
　　3.IL-18在胰腺癌組織中相對(duì)應(yīng)癌旁正常胰腺組織呈

4、明顯的高表達(dá)（p＜0.001），且IL-18的表達(dá)量與是否發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移（p＜0.05）和AJCC臨床分期密切相關(guān)；IL-18在胰腺癌組織中的表達(dá)量與生存期呈負(fù)相關(guān)（p＜0.001）。
　　結(jié)論：
　　1. IL-18可能在胰腺癌與免疫系統(tǒng)的相互作用中發(fā)揮重要作用，可以作為進(jìn)一步的研究對(duì)象。
　　2.IL-18在胰腺癌患者血漿中高表達(dá)，且與生存期呈正相關(guān)；IL-18在胰腺癌組織中高表達(dá)，且與生存期呈負(fù)相關(guān)。
　　第

5、二部分單用IL-18對(duì)胰腺癌免疫治療作用的研究
　　目的：明確IL-18對(duì)常見免疫細(xì)胞亞群的影響，并確定重組IL-18對(duì)免疫功能正常和免疫缺陷的胰腺癌原位移植小鼠生存時(shí)間的影響。
　　方法：
　　1.分離健康志愿者PBMC，體外培養(yǎng)，IL-18干預(yù)后，CCK-8檢測(cè)PBMC增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常見免疫細(xì)胞亞群的比例變化。
　　2.C57BL/6J鼠腹腔注射重組鼠IL-18一周，分離脾臟和腹腔淋巴結(jié)免疫細(xì)胞，流

6、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常見免疫細(xì)胞亞群比例的變化。
　　3.構(gòu)建IL-18﹣/﹣C57BL/6J鼠，分離脾臟和腹腔淋巴結(jié)免疫細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)常見免疫細(xì)胞亞群比例的變化。
　　4.篩選8周大C57BL/6J鼠和Balb/c裸鼠，采用鼠胰腺癌細(xì)胞系LTPA構(gòu)建胰腺癌原位移植模型，鼠重組IL-18干預(yù)，監(jiān)測(cè)小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)和生存時(shí)間。
　　結(jié)果：
　　1. IL-18可以促進(jìn)PBMC的增殖（p＜0.05），顯著增加Tc細(xì)胞（p＜

7、0.001）和NK細(xì)胞（p＜0.05）細(xì)胞的比例。
　　2.IL-18顯著增加小鼠脾臟和淋巴結(jié)中Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.相對(duì)于野生型C57BL/6J小鼠，IL-18基因敲出鼠脾臟和淋巴結(jié)中的Tc細(xì)胞（p＜0.05）和NK細(xì)胞（p＜0.05）細(xì)胞比例顯著下降。
　　4.在C57BL/6J鼠胰腺癌原位移植模型中，IL-18對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)曲線和生存曲線無影響；在Balb/c裸鼠胰腺癌原位移植模

8、型中，IL-18干預(yù)組小鼠生存時(shí)間縮短（p＜0.01），更早開始出現(xiàn)體重下降等惡病質(zhì)表現(xiàn)。
　　結(jié)論：
　　1. IL-18在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中上調(diào)Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例。
　　2.在免疫功能正常的C57BL/6J小鼠胰腺癌原位移植模型中，單用重組IL-18并不能起到治療的作用；在免疫缺陷的 Balb/c裸鼠胰腺癌原位移植模型中，重組 IL-18干預(yù)反而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，縮短荷瘤小鼠生存時(shí)間。
　　第三部分 IL-18

9、對(duì)胰腺癌增殖侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制的研究
　　目的：研究IL-18在體內(nèi)外對(duì)胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響并探討其機(jī)制
　　方法：
　　1.構(gòu)建IL-18過表達(dá)、沉默慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系panc-1和mia-paca-2。CCK-8實(shí)驗(yàn)、胰腺癌3D培養(yǎng)模型、transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-18在體外對(duì)胰腺癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響。人重組IL-18干預(yù)panc-1和mia-paca-2后，CCK-8實(shí)驗(yàn)、胰

10、腺癌3D培養(yǎng)模型，transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-18在體外對(duì)胰腺癌增殖、侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　2.構(gòu)建Balb/c裸鼠皮下移植瘤模型和胰腺癌Balb/c裸鼠脾臟種植肝轉(zhuǎn)移模型，監(jiān)測(cè)裸鼠移植瘤增長(zhǎng)情況和體重增長(zhǎng)情況，利用肝臟病理切片檢測(cè)其對(duì)胰腺癌體內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　3.基因芯片數(shù)據(jù)分析IL-18影響胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制；western blot、EMSA、雙熒光報(bào)告素酶實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-18是否

11、激活NF-κB信號(hào)通路；CCK-8實(shí)驗(yàn)、transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證IL-18是否通過NF-κB信號(hào)通路影響胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移；real-time PCR、ChIP、western blot實(shí)驗(yàn)確定IL-18激活NF-κB信號(hào)通路后的靶基因。
　　結(jié)果：
　　1.上調(diào)IL-18表達(dá)可顯著增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞系panc-1、mia-paca-2的體外增殖、侵襲、遷移能力，下調(diào)IL-18表達(dá)可抑制增殖、侵襲、遷移能力；人重組IL-1

12、8干預(yù)增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞系panc-1、mia-paca-2的體外增殖、侵襲、遷移能力；相對(duì)于對(duì)照組，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.上調(diào)IL-18表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞系panc-1、mia-paca-2皮下移植瘤的生長(zhǎng)，裸鼠在第5周逐漸出現(xiàn)體重下降等惡病質(zhì)表現(xiàn)，下調(diào)IL-18表達(dá)顯著抑制皮下移植瘤的形成和生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)裸鼠在8周實(shí)驗(yàn)內(nèi)體重穩(wěn)定增加；相對(duì)于對(duì)照組，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.上調(diào)IL-18表達(dá)可增加胰腺癌肝轉(zhuǎn)移灶，顯

13、著縮短荷瘤小鼠生存時(shí)間；下調(diào)IL-18表達(dá)可減少胰腺癌肝轉(zhuǎn)移灶，顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠生存時(shí)間；相對(duì)于對(duì)照組，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.IL-18可以通過促進(jìn)IKKα/β的磷酸化激活NF-κB信號(hào)通路，IL-18通過NF-κB信號(hào)通路影響胰腺癌的增殖和侵襲，靶基因是MMP-3、MMP-9、c-myc和cyclin-D1，NF-κB信號(hào)通路阻滯劑BAY11-7082可以阻斷IL-18對(duì)胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：

14、
　　1. IL-18可以增強(qiáng)胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　2.IL-18調(diào)控NF-κB信號(hào)通路影響胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移能力，NF-κB信號(hào)通路阻滯劑BAY11-7082可以特異性阻斷IL-18對(duì)胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。
　　第四部分選擇性阻斷其促瘤效應(yīng)后IL-18對(duì)胰腺癌免疫治療作用的研究
　　目的：研究選擇性阻斷IL-18對(duì)胰腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用后，重組IL-18是否對(duì)胰腺癌具有免疫治療

15、作用。
　　方法：
　　1.構(gòu)建沉默鼠IL-18慢病毒載體，轉(zhuǎn)染鼠胰腺癌細(xì)胞系LTPA，C57BL/6J和IL-18﹣/﹣C57BL/6J小鼠構(gòu)建鼠胰腺癌原位移植模型，分為四個(gè)組i) LTPA/C57BL/6J、ii) IL-18KD/C57BL/6J、iii) LTPA/IL-18﹣/﹣C57BL/6J、iv) IL-18KD/IL-18﹣/﹣C57BL/6J，監(jiān)測(cè)生存時(shí)間，生長(zhǎng)狀態(tài)，肝臟、肺臟病理切片檢測(cè)遠(yuǎn)處微轉(zhuǎn)移灶。<

16、br>　　2.采用鼠胰腺癌細(xì)胞系LTPA和C57BL/6J小鼠，構(gòu)建鼠胰腺癌原位抑制模型，分為四個(gè)組i) PBS、ii) IL-18、iii) BAY11-7082、iv) IL-18聯(lián)合BAY11-7082，監(jiān)測(cè)生存時(shí)間和生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1. IL-18KD/C57BL/6J組小鼠長(zhǎng)期生存，生長(zhǎng)狀態(tài)最好；LTPA/IL-18﹣/﹣C57BL/6J生存時(shí)間最短，生存狀態(tài)最差，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肝臟和肺臟 HE病

17、理切片示IL-18KD/C57BL/6J組小鼠無微轉(zhuǎn)移灶，LTPA/IL-18﹣/﹣C57BL/6J組小鼠肝臟、肺臟微轉(zhuǎn)移灶最多，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.IL-18聯(lián)合BAY11-7082組小鼠可以長(zhǎng)期生存，其他三組生存時(shí)間和生存狀態(tài)無明顯差異；IL-18聯(lián)合BAY11-7082組與其他三組相比，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：只有采用BAY11-7082選擇性阻斷IL-18對(duì)胰腺癌的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用后，IL-1