香葉醇抗胰腺癌作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章香葉醇對(duì)人胰腺癌細(xì)胞BXPC-3裸鼠皮下移植瘤的抑制作用
　　目的:觀察香葉醇對(duì)BXPC-3人胰腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用。
　　方法:建立BXPC-3人胰腺癌移植瘤模型，并隨機(jī)分為空白對(duì)照組、香葉醇作用組、吉西他濱作用組和聯(lián)合作用組。分別通過腹腔注射相應(yīng)藥物。12d后，剝出瘤塊稱移植瘤重量，光鏡及電鏡下觀察移植瘤組織形態(tài)學(xué)及瘤細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果:香葉醇可抑制裸鼠XPC-3人胰腺癌移植瘤的生長(zhǎng)，香葉

2、醇與吉西他濱及聯(lián)合作用組的抑瘤率分別為51.5％、50.9％及57.6％。
　　結(jié)論:香葉醇能夠抑制BXPC-3細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)，使其體積變小，重量減輕，對(duì)BXPC-3胰腺癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤增長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用;
　　第二章香葉醇對(duì)人胰癌細(xì)胞株BXPC-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:為驗(yàn)證香葉醇對(duì)胰腺癌的抗腫瘤作用，以人胰癌細(xì)胞株BXPC-3為研究對(duì)象，觀察香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖及凋亡的影響，探討香葉

3、醇對(duì)胰腺癌細(xì)胞BXPC-3體外粘附、遷移、侵襲以及線粒體功能的影響。
　　方法:1 MTT法進(jìn)行香葉醇有效作用濃度篩選，觀察香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞增殖的影響;2倒置顯微鏡及透射電鏡觀察BXPC-3細(xì)胞經(jīng)香葉醇單獨(dú)或聯(lián)合吉西他濱處理后形態(tài)變化情況;3流式細(xì)胞儀檢測(cè)BXPC-3細(xì)胞的凋亡率，驗(yàn)證香葉醇誘導(dǎo)BXPC-3細(xì)胞凋亡的作用;4原位末端標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡;5JC-1法檢測(cè)香葉醇對(duì)人胰癌細(xì)胞株BXPC-3線粒體電

4、位變化情況;6細(xì)胞基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)香葉醇對(duì)人胰癌細(xì)胞株BXPC-3粘附、遷移、侵襲的影響。
　　結(jié)果:1.不同濃度香葉醇作用不同時(shí)間對(duì)BXPC-3細(xì)胞細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果顯示:0.0675mM、0.125mM、0.25mM、0.5mM、1mM香葉醇作用24h、48h、72h后，BXPC-3細(xì)胞增殖呈時(shí)-效和量-效依賴關(guān)系。2.香葉醇作用不同時(shí)間的半數(shù)抑制濃度IC50為0.38 mM。以香葉醇作用于BXPC-3細(xì)胞48h

5、后IC50的1/2，即0.19 mM作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)中香葉醇的工作濃度。3.香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示:對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好;香葉醇處理組見有部分細(xì)胞脫落，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少;吉西他濱處理組也可見部分細(xì)胞脫落，貼壁細(xì)胞數(shù)量減少。聯(lián)合作用組組:貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少。4.香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞作用的透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察顯示:對(duì)照組48h BXPC-3細(xì)胞分化低，為典型惡性腫瘤細(xì)胞的形態(tài)特征。香葉醇組部分細(xì)胞出

6、現(xiàn)細(xì)胞連接消失，微絨毛消失，見凋亡小體。吉西他濱部分細(xì)胞見核分裂像和細(xì)胞凋亡改變。聯(lián)合作用組部分線粒體腫脹，細(xì)胞微絨毛消失，可見凋亡小體。5.香葉醇對(duì)人肝癌細(xì)胞BXPC-3周期作用的流式細(xì)胞結(jié)果顯示:對(duì)照組G1期細(xì)胞比例為42.6％，S期細(xì)胞比例24.7％，而62期細(xì)胞比例為32.7％。香葉醇組細(xì)胞周期發(fā)生明顯的G1期阻抑，G1期細(xì)胞比例由42.6％上升為61.5％，而S期細(xì)胞則由24.7％下降為15.9％;G2期細(xì)胞比例則由32.7％

7、下降到22.6％，細(xì)胞周期被阻滯于G1期;有部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，可見亞二倍體峰。吉西他濱組G1期細(xì)胞比例有所增加，占57.6％;S期細(xì)胞比例有所減少，為15.2％，G2期細(xì)胞比例亦較少，為27.2％;細(xì)胞被阻滯于G1期。香葉醇和吉西他濱聯(lián)合處理組細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻抑比較顯著，G1期細(xì)胞比例高達(dá)64.2％，S期細(xì)胞顯著減少，僅為7.1％，G2期細(xì)胞比例略有所增加，為29.5％;大多數(shù)細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，而且其G0/G1期阻滯效應(yīng)比香葉醇

8、或吉西他濱單獨(dú)處理要強(qiáng)，可見典型凋亡二倍體峰。6.香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞胰腺癌細(xì)胞線粒體膜電位影響的激光共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:香葉醇組、吉西他濱組、聯(lián)合作用組作用BXPC-3細(xì)胞48h后，細(xì)胞線粒體跨膜電位較對(duì)照組顯著下降(P＜0.01);但三個(gè)處理組間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。7.香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞粘附能力的影響:香葉醇與吉西他濱單獨(dú)或者聯(lián)合作用BXPC-3細(xì)胞，都能減弱其與纖維連接蛋白的粘附作用，香葉醇、吉

9、西他濱及聯(lián)合作用組的腫瘤細(xì)胞粘附抑制率分別為45.20％±1.91％;47.82％±2.05％和73.36％±1.10％。8.香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞體外運(yùn)動(dòng)能力的影響:香葉醇與吉西他濱單獨(dú)或者聯(lián)合作用BXPC-3細(xì)胞能抑制其運(yùn)動(dòng)能力，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空白組、香葉醇、吉西他濱及聯(lián)合作用組后的腫瘤細(xì)胞數(shù)分別為199.2±18.3，123.4±8.7，131.5±9.2及75.4±5.5;9.香葉醇對(duì)胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

10、:侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香葉醇和吉西他濱以及兩者聯(lián)合作用胰腺癌細(xì)胞均可顯著抑制其侵襲能力，與對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05;
　　結(jié)論:1.香葉醇能夠抑制胰腺癌細(xì)胞BXPC-3的增值，呈時(shí)效和量效關(guān)系;2.香葉醇能夠加強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞BXPC-3抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡的作用，并能抑制胰腺癌細(xì)胞BXPC-3的粘附能力、運(yùn)動(dòng)能力及侵襲能力。其誘導(dǎo)凋亡可能機(jī)制之一為降低胰腺癌細(xì)胞線粒體跨膜電位;3.香葉醇能夠誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞BX

11、PC-3凋亡，使胰腺癌細(xì)胞BXPC-3細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1阻滯。
　　第三章香葉醇抗胰腺癌作用機(jī)制的研究
　　目的:探討香葉醇誘導(dǎo)BXPC-3細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯和抑制體外侵襲能力的分子機(jī)制。
　　方法:1.凝膠遷移阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子的活性變化情況;2.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)香葉醇干預(yù)對(duì)Livin，Survivin，Bcl2，Bax及pro-caspase3，8，9等蛋白變化的影響。3.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)香

12、葉醇干預(yù)對(duì)MMP-2，MMP-9、cyt-c等蛋白變化的影響。4.RT-PCR法檢測(cè)移植瘤bcl-2、Bax、Livin和Survivin的mRNA表達(dá)差異。
　　結(jié)果:1.香葉醇干預(yù)BXPC-3細(xì)胞后，NF-κB活性變化情況:與對(duì)照比較，香葉醇干預(yù)抑制了NF-κB活性。2.香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞內(nèi)Live、Bcl2、Bax及Pro-caspase3，8，9表達(dá)的影響:蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)表明Live、Survivin、Bcl2、Ba

13、x及Pro-caspase3，8，9在BXPC-3細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，除Bax以外的蛋白香葉醇干預(yù)后表達(dá)均下降，Bax表達(dá)則上升。3.香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞胞漿內(nèi)和線粒體Cyt-c表達(dá)的影響:香葉醇干預(yù)胰腺癌細(xì)胞后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞線粒體中細(xì)胞色素(cyt-c)表達(dá)明顯降低，而胞漿中則表達(dá)增加;6香葉醇對(duì)BXPC-3細(xì)胞內(nèi)MMP-2、MMP-9、TIMP-2、NF-κB表達(dá)的影響:蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)表明MMP-2、MMP-9、TIMP-2及

14、NF-κB在BXPC-3細(xì)胞內(nèi)均有表達(dá)，除TIMP-2以外的蛋白香葉醇干預(yù)后表達(dá)均下降，TIMP-2表達(dá)則上升。4.RT-PCR檢測(cè)顯示，香葉醇作用后瘤組織中bcl-2mRNA、LivinmRNA及Survivin mRNA表達(dá)減少，Bax mRNA表達(dá)增加。
　　結(jié)論:1.香葉醇對(duì)胰腺癌細(xì)胞BXPC-3抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡的作用的可能機(jī)制是抑制BXPC-3細(xì)胞NF-κB活性及其下游基因Livin，Survivin，Bcl2的表達(dá)，