力達霉素抗胰腺癌作用的分子機制研究.pdf

1、胰腺癌是一種預(yù)后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率高，5年生存率低于5％，發(fā)病率呈逐年增加趨勢。由于胰腺癌發(fā)病隱襲，臨床表現(xiàn)多無特異性，病情進展迅速，早期缺乏敏感和特異的診斷指標，大多數(shù)患者在確診時己達晚期或有遠處轉(zhuǎn)移，只有10％～15％的患者有手術(shù)切除的機會，其中能根治者僅5％～7．5％，因此藥物治療對于胰腺癌患者來說是必不可少的治療手段。 力達霉素(Lidamycin，LDM)是從一株放線菌(Streptomycesglobi

2、sporus C-1027)代謝產(chǎn)物中獲得的對多種腫瘤細胞有強烈殺傷作用的大分子肽類抗腫瘤抗生素。力達霉素分子由一個酸性的輔基蛋白和一個烯二炔發(fā)色團組成，其中發(fā)色團是力達霉素的主要活性部分，具有斷裂DNA的作用，而輔基蛋白的主要作用是保護發(fā)色團。大量研究表明，力達霉素具有極強的抗腫瘤活性，目前正在進行臨床Ⅱ期試驗研究。本課題選用人胰腺癌PANC-1和SW1990細胞株，探討力達霉素對人胰腺癌細胞的影響及其作用機制，并通過人胰腺癌細胞SW

3、1990裸鼠移植瘤實驗，觀察力達霉素在體內(nèi)的抗胰腺癌作用。此外，還研究了力達霉素與健擇(Gemcitabine，吉西他濱)聯(lián)合作用對胰腺癌細胞的影響，并探討其作用機制，從而為力達霉素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 一、力達霉素作用于胰腺癌的體外實驗研究。 1．MTT法檢測力達霉素(LDM)對人胰腺癌PANC-1和SW1990細胞的增殖抑制作用。不同濃度的阿霉素(ADM)、絲裂霉素(MMC)、紫杉醇(Taxol)、吉西他濱(Ge

4、mcitabine)和LDM作用細胞48 h后，利用MTT法檢測各種藥物對胰腺癌細胞的增殖抑制作用。MTT結(jié)果顯示，與臨床常用化療藥物相比，LDM抑制細胞的增殖作用更強，對PANC-1和SW1990細胞的。IC<,50>值分別為0.955±0.414 nM和0.426±0.212 nM，低于其他藥物的10<'3>～10<'4>倍。 2．Hoechst 33342熒光染色法和Annexin V-FITC/PI染色結(jié)合流式細胞儀檢測

5、細胞凋亡。不同濃度LDM作用細胞48h后，細胞凋亡比率逐漸增高，呈濃度依賴性，其中0.1 nM LDM、1 nM LDM、2 nM LDM和10 nM LDM作用于PANC-1細胞的細胞凋亡率分別為12.33％±0.66％、32.26％±1.58％、45.03％±3.16％和59.44％±4.04％，作用于SW1990細胞的細胞凋亡率分別為22.21％±0.28％、22.83％±0.26％、42.52％±0.67％和50.35％±0.5

6、6％，顯著高于對照組的6.15％±1.47％和7.51％±0.45％(P<0.001)。熒光顯微鏡下可見1 nM、2 nM和10 nM LDM作用組的細胞出現(xiàn)染色質(zhì)凝集、細胞核固縮、核碎裂、形成凋亡小體等典型的凋亡細胞形態(tài)學(xué)改變。 3.利用PI單染并結(jié)合流式細胞儀檢測LDM對細胞周期的影響。檢測結(jié)果顯示，1 nM LDM主要將細胞阻滯在G2/M期，2 nM LDM能引起S期和G2/M期阻滯，10 nM LDM則主要誘導(dǎo)S期阻滯。

7、 4.利用 Transwell實驗觀察LDM對胰腺癌細胞的遷移和侵襲能力的影響。實驗結(jié)果顯示，LDM對PANC-1細胞和SW1990細胞的遷移和侵襲能力均有顯著的抑制作用，并且LDM的作用濃度越大，抑制作用越強，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴關(guān)系。 5.Western blot檢測結(jié)果顯示LDM能夠減少基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白在胰腺癌細胞中的表達水平，并且隨著LDM作用濃度的增加，抑制蛋白表達的作用亦隨之加強，提示LDM

8、通過降低細胞內(nèi)MMP-9的含量而有效抑制細胞的遷移和侵襲能力，并呈劑量依賴性。 6.Western blot和RT-PCR結(jié)果表明，LDM能夠明顯抑制胰腺癌細胞中VEGF蛋白的表達，但不影響細胞中VEGF tuRNA的表達水平，說明LDM是在轉(zhuǎn)錄后的翻譯水平對VEGF的表達進行調(diào)節(jié)。 7.細胞中K-ras蛋白和tuRNA表達水平，以及p-AKT和NF-кB蛋白含量都隨LDM作用濃度的增高而降低，呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。LD

9、M對于細胞中的AKT蛋白含量沒有影響，表明LDM能夠抑制AKT蛋白的磷酸化過程。 二、力達霉素作用于胰腺癌的體內(nèi)實驗研究。 1.利用人胰腺癌SW1990移植瘤裸鼠模型檢測LDM的體內(nèi)抗腫瘤作用。在瘤塊接種后的第7天開始給藥，每周1次，共2次。LDM通過尾靜脈注射，給藥劑量為0.02 mg/kg和0.04 mg/kg；Gemcitabine通過腹腔注射，給藥劑量為80mg/kg；對照組給予生理鹽水。動物實驗結(jié)果顯示，LDM

10、和Gemcitabine對SW1990細胞移植瘤的生長均有抑制作用，并且LDM顯示出更強的抑瘤效果。實驗第31天處死動物，剝?nèi)「鹘M動物的瘤塊進行比較，計算抑瘤率，其中Gemcitabine組的抑瘤率為38.87％，LDM 0.02 mg/kg劑量組和0.04 mg/kg劑量組的抑瘤率分別為65.71％和78.27％，與對照組相比具有顯著性差異。 2.腫瘤組織切片經(jīng)HE染色，顯微鏡下可見，LDM作用組的腫瘤組織出現(xiàn)血管減少，腫瘤細

11、胞壞死增多等病理學(xué)變化。 3.利用脫氧核糖核酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記(TUNEL)技術(shù)，對裸鼠腫瘤組織中的凋亡細胞進行觀察和比較。TUNEL實驗結(jié)果顯示，與對照組和GelncitabiIle組相比，LDM治療組中凋亡細胞明顯增多。 4.免疫組化結(jié)果顯示，LDM能夠抑制腫瘤細胞中K-ras蛋白和CD31蛋白的表達，并呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系，表明LDM具有抑制腫瘤新生血管生成的作用。 三、力達霉素與吉西他濱聯(lián)合作用于

12、胰腺癌的體外實驗研究。目前，健擇(Gemcitabine，吉西他濱)是臨床上用于治療胰腺癌的一線藥物，健擇與其他化療藥物合用治療腫瘤亦得到廣泛研究和應(yīng)用，本課題對力達霉素聯(lián)合健擇對胰腺癌細胞的作用進行了研究，并探討其主要作用機理。 1.MTT結(jié)果顯示，1 nM LDM與500 nM Gemcitabine聯(lián)合作用時，能夠明顯抑制細胞增殖，其CDI<0.75，具有協(xié)同抗腫瘤作用。 2.TUNEL實驗結(jié)果顯示，與單獨用藥相比

13、較，1 nM LDM聯(lián)合500 nMGemcitabine作用于PANC-1和SW1990細胞，能夠明顯提高凋亡細胞的比率。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，二者聯(lián)合用藥作用PANC-1和SW1990細胞的細胞凋亡率分別為59.44％±1.54％和54.68％±2.62％，顯著高于Gemcitabine單獨作用組的18.48％±0.94％和25.79％±2.06％(P<0.05)。 3.RT-PCR結(jié)果顯示，500 nM Gemcitab

14、ine和1 nM LDM聯(lián)合作用能夠顯著降低PANC-1和SWl990細胞中K-ras mRNA的表達水平。 4.Wrestern blot結(jié)果表明，LDM與Gemcitabine聯(lián)合作用于PANC-1和SW1990細胞，能夠減少細胞中K-ras蛋白的表達；500 nM Gemcitabine或1 nM LDM單獨作用時，使細胞中的NF-кB蛋白水平提高，但二者聯(lián)用能夠顯著降低細胞中NF-кB的蛋白表達水平。 5．利用熒

15、光探針JC-1負載，通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察和測定細胞線粒體膜電位的改變，結(jié)果表明，LDM與Gemcitabine聯(lián)合作用能夠明顯降低細胞的線粒體膜電位。 6．Caspase-3活性測定結(jié)果表明，LDM和Gemcitabine聯(lián)合作用，能夠?qū)е翽ANC-1和SW1990細胞內(nèi)的凋亡系統(tǒng)caspase-3蛋白酶激活；Western blot結(jié)果顯示，LDM與Gemcitabine聯(lián)合作用，能夠顯著降低PANC-1和SW1990