MiR-377在胰腺癌增殖、凋亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景
　　胰腺導(dǎo)管腺癌是全球最為致命的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤致死率中排名第4位，其5年生存率僅6％左右。由于胰腺癌具有明顯的侵襲性，80%的胰腺癌患者在疾病確診時(shí)就發(fā)現(xiàn)了早期的胰腺外轉(zhuǎn)移，使得手術(shù)及藥物治療效果很差，導(dǎo)致很高的疾病致死率和極差的預(yù)后。究其原因，其一是胰腺導(dǎo)管腺癌的早期診斷存在短板，早期預(yù)警缺乏特異性及敏感性較高的分子標(biāo)記，大多數(shù)患者在出現(xiàn)癥狀時(shí)，往往已出現(xiàn)局部侵犯和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，已經(jīng)失去了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)。

2、其二，胰腺導(dǎo)管腺癌是“高度異質(zhì)性”疾病，致病基因多變而復(fù)雜。因此，更為敏感、特異的早期胰腺癌分子標(biāo)記亟待發(fā)掘，臨床需求呼吁更為深入地研究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制和調(diào)控通路，并可能為開發(fā)新的治療胰腺癌的分子靶點(diǎn)提供思路。
　　MicroRNA是近年來目前研究最為廣泛的一種ncRNA，它在編碼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控。它被證實(shí)在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、增殖、分化、凋亡和侵襲等過程中有重要的調(diào)節(jié)作用。這些miRNAs具有穩(wěn)定性、組織

3、特異性、易獲得性和高度保守性，可以作為很好的腫瘤疾病診斷標(biāo)志物，同時(shí)這些功能性miRNAs的作用機(jī)制還遠(yuǎn)沒有被人類所認(rèn)識(shí)。
　　二、研究目的
　　本研究旨在研究miR-377在胰腺癌中的表達(dá)特征及其在胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡中的調(diào)控作用及其分子機(jī)制。
　　三、材料和方法
　　1.本研究組先運(yùn)用生物信息學(xué)方法在 GEO胰腺癌 miRNAs芯片數(shù)據(jù)庫(kù)和 TCGA胰腺癌miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出差異表達(dá)的miRNAs

4、。其中，miR-377在胰腺癌中表達(dá)特異性下調(diào)，并與臨床預(yù)后相關(guān)。
　　2.擴(kuò)大臨床樣本量，通過QT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)30例胰腺導(dǎo)管腺癌癌組織/癌旁組織，以及胰腺癌細(xì)胞/正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中miR-377的表達(dá)水平，明確其表達(dá)差異。同時(shí)利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析miR-377的表達(dá)水平與患者臨床參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　3.為了研究 miR-377在胰腺癌中的功能，我們構(gòu)建了異位 miR-377過表達(dá)和沉默慢病毒載體，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺

5、癌細(xì)胞系以進(jìn)行更為深入的功能研究。通過 CCK-8實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡、TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡研究miR-377對(duì)胰腺癌細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)活性、遷移能力、細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具分析miR-377潛在的靶基因，結(jié)果提示PIM-3可能是miR-377的靶控基因。通過QT_PCR、WB檢測(cè)異位表達(dá)miR-377

6、的胰腺癌細(xì)胞中PIM-3 mRNA水平及蛋白水平。QT_PCR檢測(cè)胰腺癌組織中miR-377與PIM-3表達(dá)量之間的相關(guān)性。WB檢測(cè)胰腺癌組織與胰腺癌細(xì)胞中PIM-3蛋白水平的差異。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)鑒定miR-377與PIM-3的直接結(jié)合活性。
　　5.通過WB技術(shù)檢測(cè)異位表達(dá)miR-377后，其靶蛋白PIM-3及下游通路蛋白的改變。
　　6.通過siRNA沉默PIM-3的表達(dá)后，檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的改變。

7、>　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用SPSS23.0軟件（Windows）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并運(yùn)用GraphPad Prism5.0.軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)圖的繪制。組間計(jì)量資料的比較采用重復(fù)測(cè)量的單因素方差分析（兩兩比較時(shí)采用配對(duì)t檢驗(yàn)）。運(yùn)用Person相關(guān)系數(shù)分析miR-377與PIM-3 mRNA之間的相關(guān)性。Kaplan-Meier生存分析來檢測(cè)miR-377與臨床生存期的關(guān)系。PIM-3 mRNA的表達(dá)水平與臨床參數(shù)之間的關(guān)系采用χ

8、2檢驗(yàn)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，P<0.05作為顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。
　　五、結(jié)果
　　1.公共數(shù)據(jù)分析結(jié)果支持 miR-377在胰腺導(dǎo)管上皮腺癌組織中下調(diào)表達(dá)。并與臨床生存預(yù)后顯著相關(guān)。
　　2. miR-377在胰腺導(dǎo)管腺癌癌組織和細(xì)胞株中特異性低表達(dá)，相對(duì)于正常胰腺組織和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞；且miR-377在胰腺癌中的表達(dá)水平與腫瘤大小、局部淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。
　　3.在胰腺癌細(xì)胞中過表達(dá)

9、miR-377后可抑制細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、遷移能力，阻滯胰腺癌細(xì)胞周期于G1/S轉(zhuǎn)換，并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，減少胰腺癌細(xì)胞對(duì)于化療藥物的耐藥性。
　　4.雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)了miR-377的靶基因是PIM-3，并通過直接結(jié)合于它的3’-UTR區(qū)對(duì)其起到負(fù)向調(diào)控作用。QT-PCR的結(jié)果顯示：miR-377的表達(dá)水平與PIM-3 mRNA的表達(dá)量呈負(fù)向相關(guān)。WB結(jié)果也顯示：miR-377是通過負(fù)向調(diào)控PIM-3蛋白水平，而PIM-3則

10、通過磷酸化Ser112 Bad蛋白，抑制Bad-Bcl-XL抗凋亡通路參與胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控。
　　5.應(yīng)用siRNA沉默PIM-3基因后，胰腺癌細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)能力、克隆形成能力、遷移能力均得到抑制，并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯、凋亡增強(qiáng)，而使穩(wěn)定沉默miR-377表達(dá)的作用被抵消。
　　六、結(jié)論
　　綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可顯示：miR-377在胰腺癌中特異性下調(diào)表達(dá)，并與臨床不良預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移