p38MAPK信號(hào)通路在胰腺癌uPA表達(dá)及其在阿霉素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞侵襲、凋亡中的作用.pdf

1、第一部分 第一節(jié):uPA、uPAR在胰腺癌中的表達(dá) 目的:探討尿激酶型纖溶酶原激活劑(UrokinasePlasminogenActivator,uPA)、尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(UrokinasePlasminogenActivatorrecepteruPAR)在胰腺癌中mRNA及蛋白水平的表達(dá)，及其表達(dá)同胰腺癌的臨床病理之間的關(guān)系，以探討UPA和UPAR在胰腺癌侵潤(rùn)及轉(zhuǎn)移中的意義。 方法:用RT-PCR檢

2、測(cè)UPA和UPAR在85例胰腺癌組織中有轉(zhuǎn)移的癌組織及無轉(zhuǎn)移的癌組織mRNA表達(dá)水平，并對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行圖像分析以確定各組標(biāo)本相對(duì)密度，t檢驗(yàn)各組差異，以比較有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織uPA和uPARmRNA水平的差異。利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)相接合在85例胰腺癌組織切片標(biāo)本中檢測(cè)癌組織，癌旁組織，淋巴結(jié)中uPA和uPAR的蛋白表達(dá)水平，并同胰腺癌臨床病理之間做比較，以確定uPA和uPAR的蛋白表達(dá)與那些胰腺癌臨床病理有關(guān)。

3、 結(jié)果:uPAmRNA在胰腺炎中表達(dá)為0.236±0.067，在不伴有轉(zhuǎn)移的胰腺癌中表達(dá)為0.639±0.052，胰腺癌中伴有轉(zhuǎn)移者為1.064±0.082。uPARmRNA在胰腺炎中表達(dá)0.463±0.0374，在不伴有轉(zhuǎn)移的胰腺癌中表達(dá)為0.692±0.0451，胰腺癌中伴有轉(zhuǎn)移者為1.105±0.076。胰腺癌組織中uPA和uPAR的表達(dá)明顯高于胰腺炎組織的表達(dá)(p＜0.05)，有轉(zhuǎn)移的癌組織比無轉(zhuǎn)移的高(p＜0.05)。uP

4、A在85例胰腺癌組織中蛋白表達(dá)陽性率為69.41％，85例癌旁組織中表達(dá)陽性率為7.06％，75例淋巴結(jié)中表達(dá)陽性率為45.33％，69例有轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中表達(dá)陽性率為76.81％。uPAR在85例胰腺癌組織中蛋白表達(dá)陽性率為72.94％，85例癌旁組織中表達(dá)陽性率為4.71％，75例淋巴結(jié)中表達(dá)陽性率為49.33％，69例有轉(zhuǎn)移的胰腺癌組織中表達(dá)陽性率為81.16％。u-PA和u-PAR的表達(dá)與性別，年齡，腫瘤部位，腫瘤大小，腫瘤病

5、理類型，TNM分期無關(guān)，與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有無侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)(p＜0.05)。 結(jié)論:uPA和uPAR是反映胰腺腫瘤進(jìn)展和生物學(xué)特性的指標(biāo)，是臨床上判斷預(yù)后的良好指標(biāo)之一。 第二節(jié):p38MAPK在胰腺癌中的表達(dá) 目的:探討絲裂原活性蛋白激酶(mitogen-activedproteinkinase，MAPK)的家族重要成員p38MAPK在胰腺癌中的蛋白表達(dá)，及分析p38MAPK表達(dá)同胰腺癌的臨床病理之間的關(guān)系，以

6、探討p38MAPK在胰腺癌的發(fā)生，發(fā)展中的作用。 方法:利用組織芯片技術(shù)同免疫組織化學(xué)技術(shù)相接合在85例胰腺癌組織切片標(biāo)本中檢測(cè)癌組織，癌旁組織，淋巴結(jié)中p38MAPK蛋白表達(dá)水平，并同胰腺癌臨床病理之間做比較，以確定p38MAPK蛋白表達(dá)與那些胰腺癌臨床病理有關(guān)。 結(jié)果:p38MAPK陽性表達(dá)于胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，少數(shù)位于胞漿內(nèi)，p38MAPK在85例胰腺癌組織中蛋白表達(dá)陽性率為85.88％，85例癌旁組織中表達(dá)陽性

7、率為21.18％，但其染色明顯較癌組織為淡。在85例總的淋巴結(jié)中表達(dá)陽性率為42.35％，而在69例有轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)組織中表達(dá)陽性率為46.38％，在16例無轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)中陽性表達(dá)率為25％。p38MAPK的表達(dá)與性別，年齡，腫瘤部位，腫瘤大小，腫瘤病理類型，組織分化無關(guān)，在有淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織中p38MAPK表達(dá)高于無淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織(X2=4.237p=0.04)，在有侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移的癌組織中p38MAPK表達(dá)高于無侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移的癌組織(X2=6

8、.586p=0.01)。 結(jié)論:信號(hào)分子p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子通路的改變?cè)谝认侔┑陌l(fā)展中起了一定作用，是反映胰腺腫瘤進(jìn)展和生物學(xué)特性的指標(biāo)，是臨床上判斷預(yù)后的指標(biāo)之一。 第二部分:p38MAPK在胰腺癌BxPC-3細(xì)胞株中表達(dá)uPA作用的研究 目的:探討p38MAPK(p38mitogen-activedproteinkinase)信號(hào)通路在人胰腺癌細(xì)胞表達(dá)尿激酶型纖溶酶原激活劑(UrokinasePlasm

9、inogenActivator,uPA)中的作用，以及p38MAPK信號(hào)通路在人胰腺癌細(xì)胞體外侵襲中的作用。 方法:用Westernblotting和RT-PCR法分別檢測(cè)BxPC-3和Aspc-1胰腺癌細(xì)胞株中p38MAPK和uPA的表達(dá)，蛋白激酶活性實(shí)驗(yàn)觀察BxPC-3細(xì)胞p38MAPK抑制劑SB203580對(duì)BxPC-3細(xì)胞內(nèi)p38MAPK活性的影響，RT-PCR觀察p38MAPK抑制劑SB203580對(duì)BxPC-3細(xì)胞u

10、PA表達(dá)的影響，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)觀察p38MAPK抑制劑SB203580對(duì)BxPC-3胰腺癌細(xì)胞株的侵襲作用。 結(jié)果:uPAmRNA在BxPC-3、Aspc-1兩株細(xì)胞株中分別是0.162±0.008和1.090±0.014，兩比較差異顯著。Westernblotting檢測(cè)檢測(cè)兩種胰腺癌細(xì)胞p38MAPK和phosph-p38MAPK，BxPC-3細(xì)胞株和Aspc-1細(xì)胞株都有p38MAPK蛋白的表達(dá)，但Aspc-1細(xì)胞株表達(dá)較弱

11、。BxPC-3細(xì)胞株內(nèi)源性p38MAPK蛋白高活性表達(dá)，而Aspc-1細(xì)胞株內(nèi)源性p38MAPK蛋白活性的表達(dá)很低。Matrigel細(xì)胞侵襲力實(shí)驗(yàn)，胰腺癌BxPC-3和Aspc-1細(xì)胞穿膜細(xì)胞的數(shù)目分別為353.33±12.78，155.66±9.72，差異有顯著性。細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予20umol/L、10umol/L、5umol/L、2umol/L、1umol/Lp38MAPK抑制劑SB203580后BxPC-3細(xì)胞的細(xì)胞

12、穿膜細(xì)胞的數(shù)目為267.33±9.71、272.00±17.35、324.33±20.60、340.33±16.04、338.33±10.97，對(duì)照組細(xì)胞穿膜細(xì)胞的數(shù)目為353.33±12.67，采用單因素方差分析F=18.186，組間比較10umol/L、20umol/LSB203580治療組同其他組差異顯著，侵襲顯著減少。10umol/LSB203580可抑制80％的Hsp27(MAPKAPK-2的一種底物)的磷酸化,20umol/

13、LSB203580可抑制90％的Hsp27的磷酸化。SB203580對(duì)p38MAPK和MAPKAPK-2的表達(dá)無影響。給予1umol/L、2umol/L、5umol/L、10umol/L、20umol/Lp38MAPK抑制劑SB203580，BxPC-3細(xì)胞株uPAmRNA的表達(dá)分別為1.079±0.002、1.075±0.013、0.996±0.129、0.872±0.075、0.839±0.134。采用單因素方差分析F=5.517，

14、10umol/L、20umol/Lp38MAPK抑制劑SB203580干預(yù)組同其他組相比，差異顯著。 結(jié)論:p38MAPK信號(hào)通路在胰腺癌BxPC-3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用；p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以誘導(dǎo)人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞表達(dá)uPA。 第三部分:阿霉素誘導(dǎo)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞侵襲、凋亡過程中p38MAPK表達(dá)的研究 目的:研究阿霉素誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡過程中p38MAPK表達(dá)的變化，探討p38MA

15、PK在其中的作用，并探討阿霉素抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲力的影響，及其發(fā)生機(jī)制。 方法:用AnnexinV-PI染色及流式細(xì)胞技術(shù)分析阿霉素及應(yīng)用p38MAPK抑制劑SB203580對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)利用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察經(jīng)阿霉素及SB203580處理人胰腺癌BxPC-3細(xì)胞后，p38MAPK的表達(dá)水平；用Boyden小室檢測(cè)經(jīng)阿霉素及SB203580處理后胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的侵襲力。 結(jié)果:SB203580(20

16、umol/L)干預(yù)組胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡率為20.1±1.35％，阿霉素作用24h后誘導(dǎo)胰腺癌BxPC-3細(xì)胞凋亡，凋亡率為31.10±2.73％，加用SB203580抑制p38MAPK通路后可增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的凋亡作用，凋亡率達(dá)40.4±2.57％。采用單因素方差分析F=136.79，組間比較組與組之間差異顯著。以20umol/L阿霉素作用BxPC-3胰腺癌細(xì)胞24h后可見p38MAPK在細(xì)胞染色后呈現(xiàn)深褐色顆粒散在分布于部分或整

17、個(gè)細(xì)胞核及細(xì)胞漿內(nèi)，聯(lián)合應(yīng)用SB203580后可見p38MAPK表達(dá)顆粒密度減低，數(shù)量減少。Boyden小室實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞株內(nèi)分別加入阿霉素(20umol/L)，SB203580(20umol/L)及合用阿霉素(20umol/L)與SB203580(20umol/L)與細(xì)胞共同孵育24h后細(xì)胞的細(xì)胞穿膜細(xì)胞的數(shù)目為267.33±9.71、285.25±9.71、255.67±14.05，對(duì)照組細(xì)胞穿膜細(xì)胞的數(shù)目為353.33±12.67，采