腫瘤干細(xì)胞樣人胰腺癌細(xì)胞在癌侵襲、轉(zhuǎn)移中作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分人胰腺癌細(xì)胞系成球能力及其CD44、CD24和ESA表達(dá)的研究
　　 目的:研究不同人胰腺癌細(xì)胞系在特殊低粘附培養(yǎng)條件下的成球能力以及該培養(yǎng)條件對(duì)其胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)志CD44、CD24和ESA表達(dá)的影響。
　　 方法：采用特殊的低粘附培養(yǎng)條件（SFM），觀察四種不同人胰腺癌細(xì)胞系(PANC-1，PC-2，MIA-Paca-2和BxPC-3)在該培養(yǎng)條件下形成腫瘤細(xì)胞球的能力。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)志CD4

2、4、CD24和ESA在不同細(xì)胞系成球前后的變化，分析SFM 培養(yǎng)對(duì)其CD44、CD24和ESA表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：四種人胰腺癌細(xì)胞系(PANC-1，PC-2，MIA-Paca-2和BxPC-3)中，只有PANC-1和MIA-Paca-2在SFM 培養(yǎng)下形成了腫瘤細(xì)胞球；在MIA-Paca-2和PC-2細(xì)胞中，只檢測(cè)到CD44的表達(dá)。在PANC-1細(xì)胞中，檢測(cè)到CD44和CD24的表達(dá)，而在BxPC-3中，三種標(biāo)志物CD44

3、、CD24和ESA 都有表達(dá)；在PANC-1 腫瘤細(xì)胞球中，CD44 陽性表達(dá)率下降(85.21％±8.74％ v.98.88％±2.38％)，CD24 陽性表達(dá)率上升(13.32％±6.15％ v．1.22％±0.57％)，CD24+CD44+上升(12.60％±5.10％ v．1.43％±0.59％)，在MIA-Paca-2 腫瘤細(xì)胞球中，CD44 陽性表達(dá)率無明顯變化(99.4±0.37％ v.99.43％±0.30％)。

4、　　 結(jié)論：人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和MIA-Paca-2 具有在SFM 培養(yǎng)下形成腫瘤細(xì)胞球的能力，胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)志CD44、CD24和ESA在不同細(xì)胞系中的表達(dá)存在明顯的不同，SFM 培養(yǎng)可以引起CD44、CD24和ESA表達(dá)的變化。
　　 第二部分人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1 腫瘤細(xì)胞球生物學(xué)特性及其SHH表達(dá)的研究
　　 目的：鑒定人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1 腫瘤細(xì)胞球在分化、致瘤性等方面的生物學(xué)特性并檢測(cè)其S

5、HH的表達(dá)。
　　 方法：將PANC-1 腫瘤細(xì)胞球改在有血清培養(yǎng)基（SCM）中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)其分化，通過流式細(xì)胞術(shù)分析其胰腺癌干細(xì)胞標(biāo)志CD44、CD24和ESA的表達(dá)測(cè)定其分化能力。通過BALB/c-scid 小鼠異種移植成瘤試驗(yàn)比較PANC-1 腫瘤細(xì)胞球與PANC-1細(xì)胞的成瘤能力，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分別檢測(cè)SHHmRNA 及SHH 蛋白在PANC-1 腫瘤細(xì)胞球中的表達(dá)。
　　

6、 結(jié)果：PANC-1 腫瘤細(xì)胞球經(jīng)誘導(dǎo)分化后，CD44+上升(94.80±4.77％ v.85.21±8.74％)，CD24+下降(1.57％±0.68％ v．13.32％±6.15％)，CD44+CD24+下降(1.55％±0.75％ v．12.60％±5.10％)，ESA-，與其來源PANC-1細(xì)胞相比，CD44、CD24和ESA的表達(dá)情況相同；在PANC-1細(xì)胞組，至少需要接種5×10 4個(gè)細(xì)胞才有腫瘤結(jié)節(jié)形成（1/3），而在PA

7、NC-1 腫瘤細(xì)胞球組，最少接種1×10 4個(gè)細(xì)胞即可觀察到腫瘤形成（3/3）。組織切片HE 染色顯微鏡下觀察，二者所形成移植瘤在組織結(jié)構(gòu)方面無明顯差異；與PANC-1細(xì)胞相比，PANC-1 腫瘤細(xì)胞球細(xì)胞中SHHmRNA 及SHH 蛋白表達(dá)均明顯升高，分別為(4.23±0.85v．1.52±0.60)和 (0.374±0.012 v．0.274±0.023)。
　　 結(jié)論：PANC-1 腫瘤細(xì)胞球具有腫瘤干細(xì)胞樣生物學(xué)特性，其

8、SHH表達(dá)無論在mRNA 還是在蛋白水平均有明顯上調(diào)。
　　 第三部分腫瘤干細(xì)胞樣人胰腺癌細(xì)胞在癌侵襲、轉(zhuǎn)移中作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：研究腫瘤干細(xì)胞樣人胰腺癌細(xì)胞在胰腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用并探討其作用與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的關(guān)系。
　　 方法：采用Transwell 小室體外遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定PANC-1 腫瘤細(xì)胞球細(xì)胞在體外的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力。通過BALB/c-scid 小鼠脾臟移植肝轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)測(cè)定其

9、肝轉(zhuǎn)移潛力。同時(shí)采用Western blot 法分別檢測(cè)E-cadherin與Vimentin 蛋白在PANC-1 腫瘤細(xì)胞球中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：與PANC-1細(xì)胞相比，PANC-1 腫瘤細(xì)胞球細(xì)胞在體外的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，分別為（1374.6±50.15v．521±34.63）和（128±7.64 v.79±17.51）；當(dāng)接種1×10 5個(gè)細(xì)胞時(shí)，PANC-1 腫瘤細(xì)胞球組即可查見肝轉(zhuǎn)移（4/12），而在PANC-

10、1細(xì)胞組，當(dāng)接種個(gè)5×10 5細(xì)胞時(shí)，才有肝轉(zhuǎn)移發(fā)生（2/12），當(dāng)分別接種5×10 5，1×10 6，5×10 6個(gè)細(xì)胞時(shí)，雖然兩組小鼠中都證實(shí)有肝轉(zhuǎn)移發(fā)生，但是與PANC-1細(xì)胞組相比，PANC-1 腫瘤細(xì)胞球組轉(zhuǎn)移發(fā)生率增加，兩組間差異均有顯著性；與PANC-1細(xì)胞相比，PANC-1 腫瘤細(xì)胞球細(xì)胞中E-cadherin 蛋白水平降低（0.415±0.005v．0.504±0.006），Vimentin 蛋白水平升高（0.504±