KAI1基因siRNA沉默對(duì)胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移作用的研究.pdf

1、研究背景與目的：高度惡性和轉(zhuǎn)移是胰腺癌的突出特征之一。一旦確診，其中80％的患者已屬晚期，5年生存率僅有1％～4％，平均生存時(shí)間五個(gè)月，且從60年代至今發(fā)病率增加1～5倍。目前，尚無有效的控制方法。導(dǎo)致這種結(jié)果可能與胰腺癌的發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有關(guān)，而其發(fā)病可能涉及多階段、多基因的異常改變。因此，從分子水平闡明胰腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要的理論及臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　Kangai1(簡(jiǎn)稱KAI1,中文名是抗癌1號(hào))是較新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤

2、轉(zhuǎn)移抑制基因。該基因?qū)儆谀ぬ堑鞍捉Y(jié)構(gòu)不同的跨膜4超家族（transmembrane 4 superfamily，TM4SF），與其它TM4SF成員一樣是通過腫瘤細(xì)胞間或腫瘤與細(xì)胞外基質(zhì)的作用，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。1996年，Guo等首先在CancerRes報(bào)道了KAI1與胰腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。但是，對(duì)KAI1基因抑制胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制并不清楚。本項(xiàng)目擬在已有研究的基礎(chǔ)上，通過RNA干擾技術(shù)阻斷胰腺癌細(xì)胞系中KAI1基因的功能

3、表達(dá)，進(jìn)一步闡明KAI1調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞遷移的作用機(jī)制，為臨床上KAI1基因治療胰腺癌等腫瘤提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：針對(duì)KAI1基因(CD82)序列，設(shè)計(jì)四個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，構(gòu)建KAI1基因RNA干擾慢病毒載體。以脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染T3細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分組加入RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行目的細(xì)胞的感染實(shí)驗(yàn)。采用實(shí)時(shí)-PCR的方法檢測(cè)目的蛋白的mRNA表達(dá)情況，進(jìn)而判斷不同靶點(diǎn)的干擾效果；采用Transwell測(cè)

4、定siRNA沉默KAI1基因前后癌細(xì)胞遷移能力變化；采用免疫熒光方法檢測(cè)siRNA沉默KAI1基因前后癌細(xì)胞MMP-9，ICAM-1及β-catenin的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：1.通過建立KAI1靶序列及構(gòu)建siRNA慢病毒載體，將其導(dǎo)入高表達(dá)KAI1的胰腺癌細(xì)胞內(nèi)；采用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)KAI1的mRNA表達(dá)，結(jié)果實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較均有顯著性差異(p<0.05),而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比無明顯差異(p>0.05)

5、。2.采用Transwell測(cè)定癌細(xì)胞遷移能力，siRNA封閉KAI1的實(shí)驗(yàn)組胰腺癌細(xì)胞的遷移能力與空白載體對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05)。3.免疫熒光方法證實(shí)siRNA沉默KAI1基因后與沉默前相比，胰腺癌細(xì)胞的MMP-9和ICAM-1表達(dá)明顯增高；且胰腺癌細(xì)胞Wnt傳導(dǎo)通路中β-catenin表達(dá)亦顯著增高。
　　結(jié)論：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)可有效抑制胰腺癌細(xì)胞KAI1基因表達(dá)；siRNA沉默KAI1基因后，胰腺癌

6、細(xì)胞中MMP-9和ICAM-1表達(dá)明顯增高，說明siRNA沉默KAI1基因后可通過增加ICAM-1的表達(dá)來加強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞與基底膜的黏附性，通過增強(qiáng)MMP-9的表達(dá)來促進(jìn)基底膜分解，進(jìn)而導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞遷移能力提高。同時(shí)，siRNA沉默KAI1基因后能夠上調(diào)胰腺癌細(xì)胞Wnt傳導(dǎo)通路中β-catenin表達(dá)。綜上所述，KAI1基因可能是通過降低胰腺癌細(xì)胞中MMP-9，ICAM-1及β-catenin的表達(dá)來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。本結(jié)果為KAI1基因的