Wnt5a信號(hào)通路在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、胰腺癌是發(fā)生在胰腺外分泌腺體的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的1-4％，其中90％以上為胰腺導(dǎo)管腺癌。胰腺癌1年生存率為8％，5年生存率小于5％，中位生存時(shí)間僅4-6個(gè)月，死亡率居惡性腫瘤第8位。由于其臨床表現(xiàn)隱匿，缺乏敏感性高、特異性強(qiáng)的早期診斷手段，大多數(shù)患者就診時(shí)已屬中晚期，因而病程兇險(xiǎn)，死亡率高，其中侵襲轉(zhuǎn)移是胰腺癌主要致死原因。因此研究胰腺癌的生長(zhǎng)侵襲轉(zhuǎn)移特點(diǎn)有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 Wnt5a是近年來備受關(guān)注的

2、Wnt家族成員。Wnts通過Wnt信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控多種細(xì)胞功能如增殖、凋亡、分化、遷移及細(xì)胞極性等，在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，各成員呈現(xiàn)獨(dú)特的表達(dá)方式和不同的功能。Wnt5a因其廣泛參與多種作用途徑并在機(jī)體發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用而備受矚目。
　　 Wnt5a參與眾多的生理性和病理性的進(jìn)程，在多種上皮和間葉性腫瘤中可見Wnt5a蛋白的異常表達(dá)。但與經(jīng)典型Wnts在腫瘤中多表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)不同，Wnt5a在腫瘤組織中表達(dá)并不一致

3、；對(duì)Wnt5a蛋白功能的研究在不同腫瘤中也常常得到互相矛盾的結(jié)果。Wnt5a對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展是致癌還是抑癌因素，眾多的實(shí)驗(yàn)得出了截然不同的結(jié)論。Wnt5a在結(jié)直腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及白血病等腫瘤中起抑癌作用，并表達(dá)下調(diào)。Wnt5a下調(diào)與更高的腫瘤分級(jí)正相關(guān)，且在不同腫瘤亞型中是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后不良的因素。而在皮膚黑色素瘤、乳腺癌細(xì)胞、胃癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等腫瘤中Wnt5a蛋白過表達(dá)且影響腫瘤的遷移和侵襲能力，呈現(xiàn)癌基因的特性

4、。
　　 因此Wnt5a在不同的腫瘤中有截然不同的表達(dá)方式和功能定位。目前在胰腺癌中，對(duì)Wnt5a蛋白表達(dá)的研究報(bào)道并不一致，其功能和作用機(jī)制仍未清楚。為了研究Wnt5a蛋白在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)形式，明確Wnt5a在胰腺導(dǎo)管腺癌中的功能定位，初步探討其作用機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)了本課題。
　　 目的：觀察Wnt5a蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)狀況，并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)建立穩(wěn)定Wnt5a蛋白過表達(dá)和低表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株，檢測(cè)不同Wnt

5、5a蛋白表達(dá)狀況對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖遷移侵襲等生物學(xué)行為的影響，初步探討Wnt5a蛋白影響侵襲轉(zhuǎn)移的途徑。
　　 方法：①通過組織芯片Wnt5a蛋白免疫組化染色，分析Wnt5a蛋白在胰腺癌腫瘤組織與癌旁組織中表達(dá)的差異；并結(jié)合臨床病理參數(shù)分析Wnt5a與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系；對(duì)病例資料進(jìn)行隨訪觀察，根據(jù)不同Wnt5a蛋白表達(dá)狀況作生存分析。②構(gòu)建Wnt5a過表達(dá)和干擾質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體法和電穿孔法將過表達(dá)和干擾質(zhì)粒導(dǎo)入胰腺癌細(xì)胞株P(guān)

6、ANC-1和BXPC-3中，篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)抗性克隆，Western-Blot驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的Wnt5a蛋白表達(dá)狀況。③觀察不同Wnt5a蛋白表達(dá)水平的胰腺癌細(xì)胞株的生物學(xué)行為；通過MTT法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)增殖能力；克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞體外增殖能力；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力；裸鼠原位成瘤實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞在裸鼠胰腺原位種植后成瘤及發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移能力。④利用熒

7、光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞EMT關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白水平的表達(dá)；⑤Western Blot方法檢測(cè)Wnt5a重組蛋白處理后Wnt5a信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)；CIAP進(jìn)行去磷酸化處理。
　　 結(jié)果：①通過對(duì)134例胰腺癌組織芯片的Wnt5a蛋白免疫組化染色發(fā)現(xiàn)胰腺癌癌旁組織中Wnt5a蛋白表達(dá)陽(yáng)性率為16.4％；癌組織陽(yáng)性率為81.3％；癌與癌旁組織中Wnt5a蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義，P<0.005。Wnt5a蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：Wnt5a蛋白表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.360,P=0.000)，與其他參數(shù)如年齡、性別、腫瘤部位、大小、神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無關(guān)。生存分析無顯著性差異。②構(gòu)建的過表達(dá)和干擾質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和基因測(cè)序驗(yàn)證序列正確。分別穩(wěn)轉(zhuǎn)PANC-1和BXPC-3人胰腺癌細(xì)胞株后經(jīng)抗性克隆和Western-Blot篩選，獲得穩(wěn)定過表達(dá)和低表達(dá)Wnt5a蛋白的PANC-

9、1及BXPC-3細(xì)胞株。③生物學(xué)行為觀察結(jié)果：生長(zhǎng)曲線顯示：與相應(yīng)空載體組相比，兩種胰腺癌細(xì)胞株過表達(dá)組增殖速度均加快，而干擾組則生長(zhǎng)受抑制；平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示兩種細(xì)胞的過表達(dá)組體外單個(gè)細(xì)胞克隆形成能力明顯增強(qiáng)；PANC-1干擾組克隆形成能力降低，BXPC-3干擾組克隆形成能力與空載體組間無顯著性差異。細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)組及干擾組與相應(yīng)空載體組之間周期分布均無顯著性差異。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)顯示過表達(dá)組早晚期凋亡均減少，干擾組早期凋亡增加，與

10、相應(yīng)空載體組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。劃痕試驗(yàn)顯示兩種細(xì)胞的過表達(dá)組在24小時(shí)時(shí)有更多的細(xì)胞遷移進(jìn)入劃痕區(qū)域，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)；相應(yīng)干擾組細(xì)胞遷移能力降低。Transewell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩組過表達(dá)組侵襲能力增加，PANC-1干擾組侵襲能力顯著降低。裸鼠原位成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)組成瘤體積大，突出胰腺范圍，在腹腔臟器表面播散?？蛰d體組相對(duì)體積小，局限于胰腺內(nèi)。顯微鏡下過表達(dá)組可見腫瘤組織突破胰腺包膜侵犯鄰近腹腔臟器，可見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移，脈

11、管內(nèi)可見癌栓。空載體組未見明確轉(zhuǎn)移。④qRT-PCR結(jié)果：BXPC-3和PANC-1細(xì)胞過表達(dá)組的WNT5A基因相對(duì)表達(dá)量分別是相應(yīng)空載體組的1.87倍和2.52倍，WNT5A基因mRNA與蛋白表達(dá)結(jié)果一致；BXPC-3細(xì)胞過表達(dá)組的Vimentin基因相對(duì)表達(dá)量是空載體組的1.96倍，E-Cadherin基因相對(duì)表達(dá)量是空載體組的0.6倍，兩者的差異顯著；PANC-1細(xì)胞過表達(dá)組Vimentin、E-Cadherin基因相對(duì)表達(dá)量與空

12、載體組之間無顯著性差異；BXPC-3和PANC-1過表達(dá)組的SNAIL基因相對(duì)表達(dá)量分別是空載體組的0.33和0.36倍，兩者的差異有顯著性。蛋白水平檢測(cè)顯示：相比空載體組，過表達(dá)組的Wnt5a、Vimentin和Snail蛋白水平較對(duì)照組高表達(dá)，而E-Cadherin蛋白水平則降低。⑤加入重組Wnt5a蛋白，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和BXPC-3胞核β-catenin增多；PANC-1和BXPC-3均表達(dá)Ror2受體，去磷酸化處理顯示

13、Ror2無明確磷酸化。
　　 結(jié)論：①Wnt5a蛋白在胰腺癌組織中呈鐘形表達(dá)模式；②PANC-1和BXPC-3胰腺癌細(xì)胞株過表達(dá)Wnt5a在體內(nèi)外均能使細(xì)胞增殖能力增加，遷移和侵襲能力增強(qiáng)；反之，降低Wnt5a的表達(dá)則會(huì)抑制細(xì)胞增殖，降低遷移和侵襲能力；③過表達(dá)Wnt5a蛋白引起了Snail蛋白表達(dá)水平上調(diào)，伴有Vimentin蛋白和mRNA表達(dá)水平的上調(diào)，E-Cadherin蛋白和mRNA表達(dá)水平的下調(diào)，顯示W(wǎng)nt5a蛋白上調(diào)