WNT5A對(duì)胰腺癌細(xì)胞化療耐藥及腫瘤血管生成作用的研究.pdf

1、背景:胰腺癌(Pancreatic carcinoma，PC)是胰腺組織的惡性腫瘤，WNT5A由胰腺癌細(xì)胞(Pancreatic carcinoma cells，PCCs)產(chǎn)生，在腫瘤的進(jìn)展過程中起重要作用。目前，有關(guān)WNT5A在胰腺癌組織中表達(dá)的病例分析比較缺乏。并且，雖然已有報(bào)道WNT5A激活PCCs的侵襲和遷移，但有關(guān)WNT5A在胰腺癌化療耐藥和血管生成方面的作用還有待研究。
　　目的:本文通過對(duì)WNT5A在胰腺癌病理組織中

2、的表達(dá)，以及WNT5A在PCCs對(duì)吉西他濱的耐藥、血管生成方面作用的研究，為胰腺癌的治療提供新的思路。方法:
　　1.收集手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的胰腺癌標(biāo)本68例，通過免疫組織化法對(duì)腫瘤和癌旁組織的WNT5A表達(dá)量進(jìn)行分析，并分析其與年齡、性別、臨床TNM分期、腫瘤分級(jí)、發(fā)生部位和腫瘤大小之間的關(guān)系;
　　2.通過小RNA干擾方法干擾WNT5A，檢測(cè)在干擾前后胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，MiaPaCa2和Capan-2對(duì)吉西他濱

3、敏感性變化。構(gòu)建WNT5A干擾和過表達(dá)質(zhì)粒系統(tǒng)，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并應(yīng)用CCK8細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥性的改變。
　　3.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)研究干擾WNT5A對(duì)細(xì)胞周期的影響。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。應(yīng)用Western blotting對(duì)WNT5A影響細(xì)胞周期蛋白的機(jī)制進(jìn)行研究，尋找WNT5A作用靶點(diǎn)激酶。通過免疫沉淀實(shí)驗(yàn)研究WNT5A調(diào)控細(xì)胞周期時(shí)相的機(jī)制。
　　4.通

4、過免疫印跡檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達(dá)量，并通過細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其在細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核的表達(dá)改變。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的轉(zhuǎn)錄水平，并通過ELISA試劑盒檢測(cè)PCCs上清液中VEGF的表達(dá)量;
　　5.應(yīng)用Transwell小室共培養(yǎng)PCCs和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)HUVECs細(xì)胞增殖情況，通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況;
　　6.構(gòu)建BALB/c裸

5、鼠異體移植瘤模型，測(cè)量裸鼠腫瘤大小計(jì)算體積，繪制腫瘤
　　增長(zhǎng)曲線。接種30天后取瘤進(jìn)行免疫組化，分析移植瘤中HIF-1α的表達(dá)量，并通過CD34染色計(jì)算微血管密度。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化結(jié)果顯示，WNT5A在胰腺癌中呈陽性表達(dá)在癌旁組織中呈陰-弱陽性表達(dá)，并且WNT5A染色評(píng)分與臨床分期與腫瘤大小相關(guān)，隨著TNM分期增加，WNT5A染色強(qiáng)度增加;
　　2.敲除WNT5A造成PANC-1、MiaPaCa2

6、和Capan-2對(duì)吉西他濱耐受性下降，通過構(gòu)建穩(wěn)定干擾和過表達(dá)WNT5A的PANC-1細(xì)胞系，同樣觀測(cè)到其對(duì)吉西他濱的耐受性隨著WNT5A的改變而改變;
　　3.通過流式測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)干擾WNT5A導(dǎo)致細(xì)胞周期G1期停滯，Cyclin DmRNA水平的下降，這種改變伴隨ser473AKT磷酸化，抑制PI3K/AKT可以阻斷WNT5A對(duì)Cyclin D蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。通過對(duì)G1/S限制點(diǎn)調(diào)控蛋白pRb-E2F的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)干擾WN

7、T5A可以穩(wěn)定pRb，使pRb-E2F復(fù)合物構(gòu)象穩(wěn)定，強(qiáng)化限制點(diǎn)功能;
　　4.WNT5A可以增加HIF-1α的穩(wěn)定性，并且促進(jìn)其細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，從而激活其靶基因VEGF mRNA水平增加和蛋白分泌增加;
　　5.共培養(yǎng)PCCs和HUVECs促進(jìn)后者增殖和遷移能力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾WNT5A導(dǎo)致胰腺癌腫瘤生長(zhǎng)停滯，微血管密度減少。
　　結(jié)論:
　　1.WNT5A在胰腺癌中高表達(dá)，并且與TNM分期相關(guān);
　　2.