Wnt5a在卵巢癌血管生成擬態(tài)中的作用.pdf

1、卵巢癌（Ovarian Carcinoma，OC）是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居宮頸癌和宮體癌之后，在女性生殖道惡性腫瘤中位于第三位。70％患者在就診時候腫瘤就已為晚期，且多發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為女性惡性腫瘤中威脅最大的疾病。血管生成擬態(tài)(Vasculogenic Mimicry, VM)是由腫瘤細(xì)胞自身變形模仿內(nèi)皮細(xì)胞組成的微循環(huán)管道，內(nèi)壁無內(nèi)皮細(xì)胞襯覆，為腫瘤組織提供血液循環(huán)，從而保持腫瘤組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定從而防止腫瘤內(nèi)部壞死的發(fā)生。V

2、M與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移以及病人預(yù)后密切相關(guān)，存在VM的患者生存期短，預(yù)后差。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(Epithelial to Mesenchymal Transition，EMT)是指上皮源性細(xì)胞在特定的生理和病理條件下向間質(zhì)源性細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象，是VM形成的關(guān)鍵步驟。Wnt5a是EMT發(fā)生的重要信號通路之一。Wnt5a信號通路既能活化經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路又能活化非經(jīng)典Wnt通路，并且二者之間相互作用，可能導(dǎo)致Wnt

3、5a在不同腫瘤中生物學(xué)作用并不一致。因此，研究Wnt5a在卵巢癌VM中的作用及其分子機制有助于豐富和完善腫瘤VM的理論研究。
　　目的：
　　本研究旨在探討Wnt5a在卵巢癌血管生成擬態(tài)形成中的作用及其可能分子機制。探討Wnt5a在卵巢癌細(xì)胞EMT發(fā)生和VM形成中的分子機制有助于豐富和完善VM理論，對腫瘤血管生成的研究具有重要意義，同時為臨床上抗腫瘤治療提供了新的思路。
　　方法：
　　1.首先對前期實驗收集來自

4、天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的79例卵巢癌患者手術(shù)切除且隨訪資料完整的臨床腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行Wnt5a、PKCa和CD44的免疫組織化學(xué)染色。并復(fù)習(xí)前期實驗的CD31/PAS雙染結(jié)果，重點觀察和分析Wnt5a表達(dá)的臨床特征以及Wnt5a與VM、Wnt5a與PKCa、Wnt5a與CD44之間的關(guān)系。
　　2.根據(jù)卵巢癌細(xì)胞系內(nèi)源性Wnt5a基礎(chǔ)表達(dá)量的水平，分別構(gòu)建穩(wěn)定上調(diào)和穩(wěn)定下調(diào)Wnt5a表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　3.構(gòu)建體外卵巢

5、癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型，觀察Wnt5a對卵巢癌細(xì)胞體外管道化形成能力的影響。
　　4.構(gòu)建體外卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移模型，觀察Wnt5a對卵巢癌細(xì)胞體外侵襲和遷移能力的影響。
　　5.免疫熒光染色觀察和Western Blotting實驗Wnt5a對卵巢癌細(xì)胞體外EMT相關(guān)蛋白的影響。
　　6.Western Blotting實驗分析Wnt5a對PKCa和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變情況。
　　結(jié)果：
　　1.W

6、nt5a表達(dá)與卵巢癌轉(zhuǎn)移和VM密切相關(guān)，是卵巢癌患者一個獨立的預(yù)后指標(biāo)。
　　應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件分析Wnt5a和主要臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，Wnt5a和卵巢癌的轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)密切相關(guān)（P=0.008），與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分型和分級、腹水等臨床病理參數(shù)無關(guān)(P＞0.05)。Wnt5a陽性組中的VM陽性率(15/25，60％)明顯高于Wnt5a陰性組中的VM陽性率(8/54，14.8％)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)

7、。生存分析顯示，Wnt5a陰性表達(dá)患者生存時間長于Wnt5a陽性表達(dá)患者，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.00)。
　　2.卵巢癌組織中Wnt5a的表達(dá)與PKCa的表達(dá)相關(guān)。
　　79例卵巢癌患者中有35例陽性，陽性率44.3％(35/79)。Wnt5a陽性組的PKCa表達(dá)率(21/25，84％)明顯高于Wnt5a陰性組(14/54，25.9％)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。
　　3.卵巢癌組織中Wnt5a的表達(dá)與

8、CD44的表達(dá)相關(guān)。
　　79例卵巢癌患者中有29例陽性，陽性率36.7％(29/79)。Wnt5a陽性組的CD44表達(dá)率(21/25，84％)明顯高于Wnt5a陰性組(8/54，14.8％)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。
　　4.Wnt5a在體外能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系的管道化能力。
　　高分化的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3形成管道能力較弱，只在邊緣部分形成少量或不完整的管狀結(jié)構(gòu)，而低分化的卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3形

9、成管道能力較強，形成管狀結(jié)構(gòu)較多且完整，管壁較厚，有多層細(xì)胞組成。上調(diào)Wnt5a后，SKOV3細(xì)胞系形成管道能力明顯增加;下調(diào)Wnt5a后，OVCAR3細(xì)胞系形成管道化能力明顯受到抑制，不能形成完整的管道，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.Wnt5a能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系EMT發(fā)生。
　　SKOV3細(xì)胞系上調(diào)Wnt5a后，免疫熒光顯示其間充質(zhì)標(biāo)記分子Vimentin表達(dá)明顯升高，而上皮標(biāo)記分子E-cadherin表達(dá)明顯降低，下調(diào)O

10、VCAR3細(xì)胞系的Wnt5a表達(dá)后，免疫熒光顯示其間充質(zhì)標(biāo)記分子Vimentin表達(dá)明顯降低，而上皮標(biāo)記分子E-cadherin表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。WB相應(yīng)的檢測EMT表征性蛋白的改變情況與免疫熒光結(jié)果一致。
　　6.Wnt5a在體外能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系的侵襲和遷移能力。
　　劃痕實驗結(jié)果顯示，SKOV3轉(zhuǎn)染上調(diào)Wnt5a質(zhì)粒后，傷口愈合趨勢明顯升高;Ovcar3轉(zhuǎn)染下調(diào)Wnt5a質(zhì)粒后，傷口愈合趨勢明顯降低，差

11、異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　Transwell實驗結(jié)果顯示，OVCAR3細(xì)胞系經(jīng)過下調(diào)Wnt5a之后，穿透能力明顯降低;SKOV3細(xì)胞系經(jīng)過上調(diào)Wnt5a處理之后，穿透能力明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　7.Wnt5a通過PKCa信號通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，形成VM，PI3K和Snail、MMP-2等調(diào)控因子發(fā)揮重要作用。
　　WB檢測顯示，將OVCAR3細(xì)胞系下調(diào)Wnt5a后PKCa表達(dá)明顯降低，而將SKOV3

12、細(xì)胞系上調(diào)Wnt5a后PKCa的表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。加入PKCa抑制劑后，SKOV3-pWnt5a細(xì)胞系的遷移能力明顯下降，提示PKCa在Wnt5a通路中起重要作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　OVCAR3細(xì)胞系下調(diào)Wnt5a之后，PI3K和Snail、MMP-2表達(dá)水平顯著降低，加入PKCa激活劑(PMA)之后，二者的表達(dá)水平明顯升高;SKOV3細(xì)胞系上調(diào)Wnt5a之后，PI3K和Snail、MMP-2表達(dá)水平顯著升

13、高，但加入PKCa抑制劑之后，二者的表達(dá)水平則明顯降低，但β-catenin的表達(dá)水平無明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1.Wnt5a表達(dá)與卵巢癌患者的轉(zhuǎn)移密切相關(guān):Wnt5a高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后差于Wnt5a低表達(dá)的卵巢癌患者，Wnt5a可以作為卵巢癌患者預(yù)后的一個指標(biāo)。
　　2.Wnt5a能通過促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞VM的形成，并能促進(jìn)其遷移和侵襲能力，在卵巢癌演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。