BNIP3在胰腺癌中的表達(dá)及調(diào)控凋亡的作用和機(jī)制.pdf

1、目的：Bcl-2/腺病毒E1B19kDa結(jié)合蛋白3（BNIP3）是Bcl-2蛋白家族BH3-only亞家族的非典型成員，盡管研究表明BNIP3作為缺氧誘導(dǎo)因子的靶基因在多種疾病過程中承擔(dān)著重要的角色，比如心肌缺血，細(xì)胞自噬，細(xì)胞凋亡，但是關(guān)于BNIP3功能不同的研究往往得出相互矛盾的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)旨在探討B(tài)NIP3在胰腺癌組織標(biāo)本中的表達(dá)及其臨床意義，研究BNIP3在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其調(diào)控胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制。
　　方法

2、：
　　(1)利用免疫熒光（IF）及免疫組織化學(xué)法（IHC）檢測(cè)BNIP3在70對(duì)胰腺癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的定位及表達(dá)，并分析BNIP3的表達(dá)與臨床病理因素、其他凋亡相關(guān)蛋白及腫瘤凋亡及增殖的關(guān)系；
　　(2)利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)（RT-PCR）和Western blot檢測(cè) BNIP3在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，BxPc-3，CaPan-1，SW1990、CFPAC-1、Patu-8988中的表達(dá)情況，分別用siRNA

3、-BNIP3轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株靶向沉默BNIP3的表達(dá)，用BNIP3全基因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株上調(diào)其表達(dá)，利用RT-PCR和Western blot確認(rèn)RNAi靶向沉默及質(zhì)粒過表達(dá)BNIP3的效果；
　　(3)沉默BNIP3及上調(diào)其表達(dá)后，利用細(xì)胞凋亡檢測(cè)、線粒體膜電位檢測(cè)，細(xì)胞活性氧檢測(cè)，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，研究BNIP3調(diào)控胰腺癌細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制；
　　(4)利用甲基化PCR檢測(cè)6株胰腺

4、癌細(xì)胞的甲基化狀態(tài)，去甲基化藥物處理細(xì)胞，分析BNIP3甲基化和其表達(dá)的相關(guān)性；
　　(5)利用CHIP實(shí)驗(yàn)分析BNIP3甲基化對(duì)缺氧誘導(dǎo)因子和其啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)BNIP3在胰腺癌組織中的陽性率明顯低于癌旁組織，且兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.457，P<0.001），兩者陽性表達(dá)率分別為35.7％和72.9%；BNIP3的表達(dá)與臨床病理因素的分析結(jié)果顯示，BNIP3的低表達(dá)與腫瘤大小

5、、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分級(jí)無明顯相關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。胰腺癌組織中BNIP3的表達(dá)和促凋亡蛋白表達(dá)Bax正相關(guān)，和抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)負(fù)相關(guān)，其低表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖活躍、凋亡減少有關(guān)；
　　(2)RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，常氧條件下BNIP3的mRNA和蛋白水平在六株胰腺癌細(xì)胞株中除一株低表達(dá)外，其余的5株均表

6、達(dá)沉默，且缺氧條件培養(yǎng)并未誘導(dǎo)其表達(dá)。
　　(3)通過上調(diào)及下調(diào)BNIP3表達(dá)發(fā)現(xiàn)BNIP3可以調(diào)控線粒體途徑相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，和誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生、線粒體膜電位的下降及細(xì)胞凋亡。
　　(4)甲基化PCR檢測(cè)證實(shí) BNIP3啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化和其在胰腺癌中的低表達(dá)密切相關(guān)，BNIP3啟動(dòng)子區(qū)的甲基化影響了缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和其啟動(dòng)子區(qū)缺氧反應(yīng)元件的結(jié)合。
　　結(jié)論：BNIP3在胰腺癌組織中低表達(dá)，BNIP3的