慢性胰腺炎至胰腺癌演變模型中Hedgehog通路的分子機(jī)制.pdf

1、一、研究背景
　　 慢性胰腺炎（chronic pancreatitis，CP）是一種多因素共同參與的炎癥過程，胰腺小葉內(nèi)或小葉間纖維組織大量增生累及胰腺實(shí)質(zhì)和胰管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胰腺內(nèi)外分泌功能受損，其特征是胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cells，PSCs）活化，合成并釋放大量細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，引起胰腺組織進(jìn)行性纖維化。
　　 胰腺癌惡性程度高，預(yù)后差，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明

2、。其癥狀隱匿、惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、早期診斷困難，大多數(shù)患者在確診后由于進(jìn)展期惡性病變的出現(xiàn)而無法施行根治手術(shù)，5年生存率小于5％。臨床上很難獲得新鮮的、不同時(shí)期的胰腺癌組織標(biāo)本，更不可能在臨床上觀察胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程。因此，為了研究解決胰腺癌的發(fā)生機(jī)制、病理變化過程以及臨床的早期診斷和治療等問題，需要建立胰腺癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 Hedgehog信號(hào)通路是調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中的主要信號(hào)通路，由Hedgehog 配體、2個(gè)跨

3、膜蛋白受體Ptc和Smo 以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白等組成。Ptc和Smo是位于細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，其中Ptc為Hedgehog的受體，能與Hedgehog蛋白結(jié)合。當(dāng)不存在Hedgehog蛋白時(shí)，Ptc 抑制Smo的活性，進(jìn)而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)Hedgehog蛋白與Ptc 結(jié)合時(shí)，Smo上的抑制效應(yīng)被解除，激活下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Gli，G1i蛋白進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。Hedgehog信號(hào)通路與某些惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，

4、包括胰腺癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤中均可觀察到Hedgehog信號(hào)通路的異常表達(dá)。
　　 環(huán)巴明(cyclopamine)是Hh通路的特異性抑制劑，一種從百合科藜蘆屬植物中提取的異甾體類生物堿，具有明顯的抗腫瘤作用。Cyclopamine 主要通過與Smo 結(jié)合使Smo的空間構(gòu)象發(fā)生改變，抑制Smo的活性，從而抑制Hh信號(hào)通路的活性，發(fā)揮抗腫瘤作用。Thayer等對(duì)胰腺癌體外細(xì)胞試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的體內(nèi)試驗(yàn)研究均顯示cyclopam

5、ine 可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，能明顯抑制胰腺腫瘤細(xì)胞的生長和分化。既往的研究表明,環(huán)巴明可顯著抑制多種因該信號(hào)通路過度激活所致的腫瘤生長,并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 二、研究內(nèi)容
　　 第一部分建立大鼠慢性胰腺炎和胰腺癌模型
　　 目的建立大鼠慢性胰腺炎和胰腺癌模型，動(dòng)態(tài)研究大鼠CP 病變的形成過程，并動(dòng)態(tài)觀察胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程。方法健康雄性SD大鼠110只，隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（n=10）；慢性胰腺炎模型組

6、（n=50）；胰腺癌模型組（n=50）。建立大鼠CP 模型：將大鼠置于固定器中，暴露尾靜脈，對(duì)照組尾靜脈注射100％乙醇和甘油配制成的有機(jī)溶劑（1ml/kg），模型組尾靜脈注射二丁基二氯基錫（dinbutyltin dichloride，DBTC）溶液（8mg/ml/kg）。建立大鼠PC 模型：3％戊巴比妥鈉1.5 ml/kg 體重腹腔內(nèi)注入麻醉，經(jīng)上腹正中切口進(jìn)腹，暴露胰腺后，于體尾部切開胰腺被膜及部分實(shí)質(zhì)，深1mm，模型組置入9mg

7、 DMBA，縫合胰腺被膜后關(guān)腹。對(duì)照組除不置DMBA 外，其余同模型組。通過HE 染色了解組織學(xué)改變，Sirius Red 染色后應(yīng)用圖像定量分析系統(tǒng)測(cè)定膠原含量。結(jié)果 CP 模型組大鼠發(fā)生慢性胰腺炎34只(73.9％)，HE 染色顯示第6周出現(xiàn)不同程度的腺泡壞死、萎縮，淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，小葉內(nèi)或小葉周圍纖維化形成，伴胰管改變。 Sirius Red 染色，CP 模型組膠原沉積在導(dǎo)管周圍至小葉內(nèi)和小葉周圍，對(duì)照組僅見血管壁膠原沉積

8、，CP 模型組膠原含量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。PC 模型組大鼠發(fā)生胰腺導(dǎo)管癌23只(57.5％)，對(duì)照組胰腺組織均無明顯病理變化。鏡下細(xì)胞呈腺管樣分布，腺腔大小不一，核異型明顯，細(xì)胞核增大，核漿比例增加。核大小、形態(tài)、染色不一，病理性核分裂象多見，其內(nèi)可見胰腺結(jié)構(gòu)完全消失。
　　 結(jié)論本部分成功構(gòu)建了大鼠CP、PC 模型，由胰腺病理改變證實(shí)造模成功。本研究動(dòng)態(tài)展示了大鼠CP 病變的形成過程，由胰腺組織

9、病理學(xué)改變的一些指標(biāo)，如腺泡萎縮、纖維化、炎癥細(xì)胞浸潤等證實(shí)造模成功。我們可以獲得新鮮的、不同時(shí)期的大鼠胰腺癌組織標(biāo)本，使動(dòng)態(tài)觀察胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程成為可能。
　　 第二部分 Hedgehog信號(hào)通路蛋白在慢性胰腺炎、胰腺癌組織中的表達(dá)
　　 目的在第一部分構(gòu)建的慢性胰腺炎、胰腺癌模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測(cè)大鼠慢性胰腺炎和胰腺癌組織中Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，以探討Hedgehog信號(hào)通路在慢性胰腺炎和胰

10、腺癌發(fā)生過程中的作用及其機(jī)制。方法 Envision免疫組化方法檢測(cè)胰腺組織PTCH、Smo、Gli1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 PTCH、Smo、Gli1蛋白在慢性胰腺炎組織中陽性表達(dá)率分別為73.5％、64.7％、52.9％，PTCH、Smo、Gli1蛋白在胰腺癌組織中陽性表達(dá)率分別為82.6％、73.9％、65.2％。在正常胰腺組織中PTCH、Smo、Gli1蛋白未見陽性表達(dá)。PTCH、Smo、Gli1蛋白在CP、PC兩模型組胰腺組織中的陽

11、性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ((P＞0.05)。PTCH、Smo、Gli1蛋白在CP、PC兩模型組胰腺組織中均呈高表達(dá),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ((P＞0.05)。結(jié)論在慢性胰腺炎和胰腺癌組織中可能存在Hh信號(hào)通路的過度激活現(xiàn)象。在CP 發(fā)病過程中，Hedgehog通路發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，Hedgehog信號(hào)通路參與胰腺慢性炎癥反應(yīng)和纖維化進(jìn)程，，Hedgehog信號(hào)通路可能是促進(jìn)慢性胰腺炎進(jìn)展的重要機(jī)制。綜上所述，hedgehog信號(hào)通路的

12、異常激活在胰腺癌的發(fā)病機(jī)制中可能起到了重要的作用，而這種異常激活的狀態(tài)可能與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，提示該通路基因的表達(dá)有助于胰腺癌的診斷。
　　 第三部分 Hedgehog通路阻斷劑環(huán)巴明抑制胰腺癌的機(jī)制探討
　　 目的我們應(yīng)用二甲基苯并蒽(DMBA)置入SD大鼠胰腺實(shí)質(zhì)內(nèi)建立胰腺癌模型，應(yīng)用環(huán)巴明進(jìn)行干預(yù)，探討環(huán)巴明對(duì)胰腺癌發(fā)生的影響。本研究檢測(cè)大鼠胰腺癌組織中Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，以探討環(huán)巴明

13、在胰腺癌發(fā)生過程中的作用及其機(jī)制。方法160只雄性SD大鼠隨機(jī)分為A組（胰腺癌模型組，n=50）、B組（預(yù)防組，n=50）、C組（治療組，n=50）、D組（對(duì)照組，n=10）四組，胰腺癌模型的制備方法同第一部分，B組、C組分別于制模后當(dāng)天開始每天腹腔注射4mg/Ml的環(huán)巴明溶液1mL、2ml。D組除未置入DMBA 外，余同A組，術(shù)后4個(gè)月處死。HE 染色了解各組組織學(xué)變化，Envision免疫組化方法檢測(cè)胰腺組織PTCH、Smo、Gli

14、1蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)定胰腺組織中PTCH、Smo、Gli1mRNA的表達(dá)。結(jié)果A組大鼠發(fā)生胰腺導(dǎo)管腺癌23只(57.5％),B組大鼠發(fā)生胰腺導(dǎo)管腺癌10只(22.7％),C組大鼠發(fā)生胰腺導(dǎo)管腺癌4只(8.51％)。 A組發(fā)癌率高于B、C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，D組胰腺組織均無明顯病理變化。PTCH、Smo、Gli1蛋白在胰腺癌模型組(A組)中的陽性表達(dá)率顯著高于預(yù)防組（B組）、治療組（C組)

15、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ((P＜0.05)。給予環(huán)巴明治療后，預(yù)防組（B組）、治療組（C組)PTCH、Smo、Gli1蛋白的表達(dá)明顯降低。正常對(duì)照組（D組）、預(yù)防組（B組）、治療組（C組)大鼠胰腺組織PTCH、Smo、Gli1mRNA呈低表達(dá)，胰腺癌模型組(A組)大鼠胰腺組織PTCH、Smo、Gli1mRNA 均呈高表達(dá)，A組大鼠胰腺組織PTCH、 Smo、 Gli1Mrna的表達(dá)量均顯著高于B、C、D 三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05

16、)。給予環(huán)巴明治療后，預(yù)防組（B組）、治療組（C組)大鼠胰腺組織PTCH、Smo、Gli1Mrna的表達(dá)量明顯降低。結(jié)論給予環(huán)巴明干預(yù)治療后，預(yù)防組（B組）、治療組（C組)PTCH、Smo、Gli1蛋白的陽性表達(dá)明顯降低，B、C組大鼠胰腺組織PTCH、Smo、Gli1mRNA的表達(dá)量明顯降低。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，環(huán)巴明有可能作為一種特異性的腫瘤細(xì)胞抑制藥物，本試驗(yàn)結(jié)果將為環(huán)巴明在胰腺癌中的治療作用提供一定的理論依據(jù)，為胰腺癌的藥物治療提供