MEKK1與胰腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究;Icogenin體外抗胰腺癌作用及其機(jī)制研究.pdf

1、胰腺癌是一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)2002年全球癌癥統(tǒng)計(jì)，胰腺癌的發(fā)病率占第11位，而死亡率卻已經(jīng)上升至第8位。死亡率高的主要原因與胰腺癌惡性度高，診斷時(shí)大多數(shù)患者已經(jīng)到了晚期，腫瘤過(guò)大(直徑大于4cm)、浸潤(rùn)到周?chē)K器或者已經(jīng)發(fā)生了淋巴轉(zhuǎn)移。胰腺癌復(fù)發(fā)率高，即使進(jìn)行了手術(shù)也預(yù)后極差。因此，尋找與胰腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的特異基因或蛋白具有重要意義。 目前研究表明，胰腺癌的組織和細(xì)胞已有許多基因發(fā)生了突變，比如VEGF、EGF、No

2、tch、IGF、MUC、K—Ras、PI3K—AKT和sonic hedgehog等。這些突變因子主要?dú)w屬于3條重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：Ras—MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、PI3K—AKT—mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。K—ras基因在胰腺癌患者中的突變率高達(dá)90％以上，突變的k—ras基因?qū)е翿as蛋白的持續(xù)激活，激活的Ras蛋白自身磷酸化并激活其下游蛋白，包括Ras—MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個(gè)重要結(jié)點(diǎn)——MEKK1也被激

3、活。 MEKK1是MAP/ERKKK1激酶的縮寫(xiě)，屬于MAPKKK家族的成員，在MAPK信號(hào)通路中處于結(jié)點(diǎn)位置，也是MAPK通路與其他信號(hào)通路的結(jié)點(diǎn)，包括IKK—NFκB通路、JAK—STAT通路和GSK3p通路。MEKK1具有重要的生物學(xué)功能，如影響細(xì)胞的存活和凋亡，參與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道與胃癌、乳腺癌和卵巢癌的侵襲密切相關(guān)。全長(zhǎng)的MEKK1是196kD的蛋白，可與許多蛋白都發(fā)生相互作用，如骨架蛋白、絲氨酸/蘇氨

4、酸激酶和粘著斑相關(guān)的酪氨酸激酶(FAK)等?；罨腗EKK1又可激活其下游的JNK通路、P38通路和ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 為探索MEKK1在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究首先采用RT-PCR方法對(duì)不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞株及正常細(xì)胞株中MEKK1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果2株胰腺癌細(xì)胞BxPC3和Capan2均呈高表達(dá)。隨后，將胰腺癌細(xì)胞系增加到4株(BxPC3、Capan2、SW1990和PANC1)，并運(yùn)用多種方法對(duì)M

5、EKK1的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。如運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)了mRNA水平的表達(dá)差異，采用Western Blot和免疫熒光方法檢測(cè)了蛋白水平的表達(dá)差異。結(jié)果MEKK1在BxPC3細(xì)胞株中表達(dá)水平最高，Capan2的表達(dá)水平其次，SW1990和PANC1表達(dá)水平均較低。同時(shí)也采用RT-PCR方法檢測(cè)了4株胰腺癌MEKK2、MEKK3和MEKK4的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果MEKK4在4株胰腺癌細(xì)胞系的表達(dá)模式與MEKK1相似。 為探討MEK

6、K1與胰腺癌細(xì)胞生物行為之間的關(guān)系，對(duì)4株胰腺癌細(xì)胞株的生物學(xué)行為進(jìn)行了檢測(cè)。采用軟瓊脂集落方法檢測(cè)其惡性度，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其運(yùn)動(dòng)能力，粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其異質(zhì)粘附特性，Transwell方法檢測(cè)其侵襲能力。結(jié)果表明，4株胰腺癌細(xì)胞中BxPC3細(xì)胞的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移能力和惡性度都為最高，粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的變化趨勢(shì)與MEKK1的表達(dá)水平相一致。因此推測(cè)胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性可能與MEKK1和/或MEKK4的高表達(dá)有關(guān)。 為進(jìn)一步探

7、討MEKK1是否與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，本文以MEKK1表達(dá)水平最高和侵襲轉(zhuǎn)移能力最強(qiáng)的BxPC3細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用RNA干擾技術(shù)對(duì)MEKK1基因進(jìn)行沉默，檢測(cè)沉默后該細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移以及分泌MMP的能力。結(jié)果表明，MEKK1基因沉默后，BxPC3細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移以及分泌MMP2的能力均低于未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的BxPC3細(xì)胞(P<0.05)。 MEKK1的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有ER

8、K通路、JNK通路和P38通路。MEKK1的哪條下游通路在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中起主要作用尚不清楚，為此檢測(cè)了MEKK1沉默后其下游蛋白ERK、JNK和P38磷酸化與非磷酸化水平。結(jié)果只有磷酸化ERK的表達(dá)水平明顯下降，而磷酸化的JNK和p38只為輕度抑制。提示MEKK1參與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移主要通過(guò)ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。 為進(jìn)一步探討MEKK1在人胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，與哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院合作，對(duì)2001年到2006年的41

9、例胰腺癌患者的組織標(biāo)本進(jìn)行了回顧性分析。采用組織化學(xué)方法檢測(cè)了組織標(biāo)本中的MEKK1蛋白表達(dá)，結(jié)合患者病理特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，MEKK1陽(yáng)性例數(shù)有32例(占78.1％)，MEKK1表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移、TNM分級(jí)和腫瘤分化程度高度相關(guān)(P<0.01)，而與患者的年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤發(fā)生部位等不相關(guān)(P>0.05)。MEKK1的蛋白表達(dá)主要位于胞漿，但隨著分化程度的不同，其細(xì)胞定位有所改變，高分化癌的細(xì)胞核中幾乎沒(méi)有表達(dá)，中分化癌細(xì)

10、胞核中表達(dá)增加，而低分化癌細(xì)胞核中全部都有表達(dá)。ERK的蛋白表達(dá)也與MEKK1呈正相關(guān)。提示MEKK1蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)與分化程度密切相關(guān)，且在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起一定的作用，并且與ERK高度相關(guān)。 綜上所述，MEKK1的蛋白高表達(dá)與胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，并且與其下游基因ERK高度相關(guān)，MEKK1很可能成為治療胰腺癌的潛在分子靶點(diǎn)。 Icogenin是由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所化學(xué)合成室雷平生研究員課題組從龍血樹(shù)(

11、Dracaena draco)中提取的一種甾體皂苷，具有一定的細(xì)胞毒作用。前期MTT篩選實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Icogenin對(duì)胰腺癌PANC1細(xì)胞和人鱗狀上皮癌A431細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)。目前臨床上治療胰腺癌最理想的辦法仍是外科根治手術(shù)加藥物化療，對(duì)于不能手術(shù)或進(jìn)行姑息性手術(shù)的患者，化療則更為重要，而細(xì)胞毒性藥物在目前臨床實(shí)施的化療方案中仍占主導(dǎo)地位，因此研究Icogenin的抗胰腺癌作用及其作用機(jī)制則具有重要意義。 本研究采用人

12、胰腺癌細(xì)胞株BxPC3作為體外細(xì)胞研究對(duì)象，MTT方法測(cè)得Icogenin的IC50為0.84±0.10μmol/L，但斜率較陡。5μmol/L Icogenin可明顯地抑制BxPC3細(xì)胞生長(zhǎng)和集落形成，使BxPC3細(xì)胞阻滯在G2/M期，Icogenin作用6h即可誘導(dǎo)BxPC3細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞內(nèi)核小體DNA斷裂出現(xiàn)典型的梯形條帶。同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)、AO/EB染色等多種方法均證實(shí)了細(xì)胞凋亡的存在。Western blot結(jié)果表明，Ico

13、genin誘導(dǎo)BxPC3細(xì)胞凋亡主要與抑制線粒體通路的bcl—2家族有關(guān)(Bax、bcl—xl、Bak、bcl—2等均有變化)，而與P53無(wú)關(guān)。誘導(dǎo)凋亡劑量對(duì)于MAPK信號(hào)通路的影響則是磷酸化的ERK和P38蛋白表達(dá)水平降低，而磷酸化的JNK蛋白表達(dá)水平增加。 體外實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在低于凋亡劑量(1μmol/L小于48h的IC10)的Icogenin還具有抗胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移作用。研究中分別采用穿膜方法、粘附實(shí)驗(yàn)和單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)探討Ic

14、ogenin對(duì)胰腺癌BxPC3細(xì)胞侵襲、粘附和運(yùn)動(dòng)能力的影響。Western blot方法檢測(cè)Icogenin對(duì)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路蛋白表達(dá)水平的影響，明膠酶譜法分析Icogenin對(duì)MMP2分泌的影響。結(jié)果表明，Icogenin在體外可顯著抑制人胰腺癌BxPC3細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)以及粘附能力(P<0.05)，并呈較好的劑量依賴(lài)關(guān)系，ERK抑制劑PD98059和U0126也可抑制BxPC3細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。Icogenin可抑制MMP