碳酸酐酶IX在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中作用的研究.pdf

1、目的:
　　探討胰腺癌中碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydraseⅨ，CAⅨ)表達(dá)的臨床病理學(xué)意義;同時檢測CAⅨ自身及碳酸酐酶抑制劑對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及調(diào)控胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移可能的機(jī)制。
　　方法:
　　收集2005年1月至2012年12月我院具有完整臨床資料的胰腺導(dǎo)管腺癌手術(shù)切除標(biāo)本58例，均有癌旁組織作為對照。另有18例胰腺癌及配對的癌旁組織新鮮標(biāo)本。58例患者術(shù)后病理證實為胰腺導(dǎo)管腺癌，胰

2、腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC-1、BxPC-3、PANC-1及Miapaca-2常規(guī)培養(yǎng)及進(jìn)行后續(xù)藥物和轉(zhuǎn)染實驗。采用的實驗方法:(1)免疫組織化學(xué)(IHC)檢測58例配對的胰腺癌和癌旁組織中CAⅨ蛋白表達(dá)水平，探討其表達(dá)的臨床病理學(xué)意義。(2)細(xì)胞培養(yǎng):AsPC-1、BxPC-3、PANC-1及Miapaca-2細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)。(3)qRT-PCR檢測CAⅨ的mRNA在胰腺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)水平。(4)Western blot檢測CAⅨ蛋白在胰

3、腺癌細(xì)胞和組織中表達(dá)水平。(5)免疫熒光IF檢測CAⅨ在細(xì)胞中表達(dá)水平及定位。(6)瞬時轉(zhuǎn)染驗證CAⅨ干擾效果同時，對細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)指標(biāo)E-cad和vimentin的影響。(7)Transwell侵襲實驗和細(xì)胞遷移實驗檢測CAⅨ沉默后胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移力的影響。(8)觀察乙酰唑胺對CAⅨ表達(dá)的影響，同時通過Transwell侵襲實驗和細(xì)胞遷移實驗觀察其對胰腺癌細(xì)胞侵襲和遷移力的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)IHC結(jié)果顯

4、示:CAⅨ在58例配對的胰腺癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(t=2.872;P=0.006)。CAⅨ主要呈胞漿和胞膜的表達(dá)，其高表達(dá)與胰腺癌的腫瘤大小(X2=5.066;P=0.024)及UICC分期(X2=5.553;P=0.018)呈正相關(guān)，但與患者性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵潤及術(shù)前CA199水平無相關(guān)性。單因素分析發(fā)現(xiàn)，CAⅨ高表達(dá)胰腺癌患者預(yù)后差(P=0.016)，腫瘤UICC分期(P=0.005)、淋

5、巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.005)、血管侵潤(P=0.044)及術(shù)后肝轉(zhuǎn)移(P=0.001)同樣是影響胰腺癌預(yù)后因素。多因素分析發(fā)現(xiàn)，CAⅨ表達(dá)(P=0.019)與胰腺癌術(shù)后肝轉(zhuǎn)移(P=0.006)是影響胰腺癌患者預(yù)后獨立危險因素。(2) Western blot結(jié)果顯示:CAⅨ在18例胰腺癌中蛋白表達(dá)明顯高于配對的癌旁正常組織(t=3.278;P=0.004)。qRT-PCR顯示:CAⅨ在18例胰腺癌中mRNA表達(dá)明顯高于配對的癌旁正常組織（

6、t=2.449;P=0.025）。(3) Western blot和qRT-PCR結(jié)果顯示:CAⅨ蛋白和mRNA表達(dá)在PANC-1和BxPC-3中較低，在AsPC-1和Miapaca-2中較高，故我們選擇AsPC-1和Miapaca-2細(xì)胞擬下一步CAⅨ干擾實驗。(4)IF同樣顯示CAⅨ熒光在PANC-1和BxPC-3中較弱，在AsPC-1和Miapaca-2中較強(qiáng)。其在胰腺癌細(xì)胞中主要呈胞漿的表達(dá)。(5)CAⅨ在AsPC-1和Miap

7、aca-2細(xì)胞中有明顯干擾效果，表現(xiàn)為蛋白和mRNA水平較對照組出現(xiàn)明顯下調(diào)。但CAⅨ沉默并不影響與侵襲和遷移相關(guān)指標(biāo)E-cad及vimentin的表達(dá)。(6)CAⅨ沉默明顯抑制了AsPC-1和Miapaca-2胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。(7)應(yīng)用碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺能夠抑制部分胰腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)部分胰腺癌細(xì)胞的凋亡。抑制CAⅨ表達(dá)同時，同樣抑制AsPC-1和Miapaca-2胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。提示乙酰唑胺可能通過抑制CAⅨ表