Rab11-FIP4 在胰腺癌預(yù)后及發(fā)生發(fā)展中的作用研究.pdf

1、目的：
　　胰腺癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全世界和我國(guó)都呈逐年上升趨勢(shì)，2015年我國(guó)新增病例約52800例，其中男女病例為2.45:2.83,死亡病例約40700例，胰腺癌已經(jīng)是我國(guó)第10大常見侵襲性腫瘤，在惡性腫瘤患者的致死率中位列第7位。胰腺癌的早期癥狀不典型，診斷困難，并且容易侵犯胰腺周圍組織和發(fā)生轉(zhuǎn)移，診斷時(shí)多已處于晚期，導(dǎo)致其治療效果欠佳，手術(shù)治療、放療和化療效果均不理想，預(yù)后極差，5年生存率低下。CA1

2、9-9、CA242等腫瘤標(biāo)志物對(duì)于胰腺癌的臨床診斷有一定幫助，但是其特異性低，早期診斷意義有限。近年來，越來越多胰腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，但是其根本機(jī)制仍不清楚。胰腺癌治療效果差，早期診斷困難，根本原因主要是胰腺癌發(fā)生發(fā)展的病因及機(jī)制迄今仍未完全研究透徹。因此，探索的胰腺癌的發(fā)生因素及致病機(jī)制，為胰腺癌的綜合防治提供新思路具有深遠(yuǎn)意義。Rab11家族相互作用蛋白質(zhì)（Rab11-family interacting protei

3、ns，R ab11-FIPs)是一個(gè)高度保守的蛋白家族，為Rab和Arf GTP酶的效應(yīng)因子，并與Rab11之間有緊密聯(lián)系，具有調(diào)節(jié)回收物質(zhì)至細(xì)胞表面，細(xì)胞分裂過程中轉(zhuǎn)運(yùn)膜至中間體或者卵裂溝，連接 Rab11和分子動(dòng)力蛋白的作用。研究表明，Rab11-FIPs同時(shí)在其他幾個(gè)重要的細(xì)胞功能生理過程中發(fā)揮重要功能,包括胰島素的效應(yīng)過程、記憶形成過程、免疫和炎癥反應(yīng)、水重吸收、生育、視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)育和多種人類癌癥，并且多個(gè)在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中

4、扮演重要的角色。作為第二類FIPs亞家族成員，Rab11家族相互作用蛋白質(zhì)4（Rab11-family interacting protein4，Rab11-FIP4)特有EF-hand和脯氨酸富含區(qū)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)定位于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)再循環(huán)內(nèi)體、高爾基體反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Rab11-FIP4與 Rabll一起參與膜泡從再循環(huán)內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)至分裂溝的過程，在細(xì)胞分裂中晚期中起重要作用。Rab11-FIP4可影響人巨細(xì)胞病毒產(chǎn)物的形成，調(diào)節(jié)HeLa細(xì)胞中

5、Rab11距細(xì)胞核膜的位置，促進(jìn)小鼠和斑馬視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的生長(zhǎng)。近期研究表明， Rab11-FIP4與HIF-1α在肝癌細(xì)胞中存在高表達(dá)，并與肝癌惡性程度呈正相關(guān)。在低氧條件下，HIF-1α誘導(dǎo)Rab11-FIP4表達(dá)，促進(jìn)肝癌向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，表明肝癌細(xì)胞中Rab11-FIP4是HIF-1α的一個(gè)靶向基因，即HIF-1α可能為Rab11-FIP4的轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α表達(dá)與胰腺癌的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移及臨床結(jié)果關(guān)系密切，但是尚無(wú)Rab11-F

6、IP4對(duì)胰腺癌發(fā)生發(fā)展影響的報(bào)道，Rab11-FIP4表達(dá)的臨床病理意義及其對(duì)胰腺癌形成產(chǎn)生的影響目前仍不明確。因此，本研究的目的是探索Rab11-FIP4基因?qū)σ认侔┑念A(yù)后的影響及在胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng),侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，為胰腺癌的治療提供新的策略。
　　方法：
　　⑴于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、第二醫(yī)院收集60對(duì)胰腺癌術(shù)后標(biāo)本和相應(yīng)癌旁正常組織樣本。通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)60對(duì)胰腺癌組織及癌旁組織中Rab11-FIP4蛋白

7、質(zhì)表達(dá)水平；根據(jù)胰腺癌組織中Rab11-FIP4蛋白表達(dá)水平，結(jié)合患者的臨床資料，分析其與患者臨床病理數(shù)據(jù)之間的聯(lián)系。⑵Real-time PCR檢測(cè)CFPAC-1, PANC-1和 AsPC-1細(xì)胞系中Rab11-FIP4 mRNA表達(dá)水平，選擇適度表達(dá)Rab11-FIP4的細(xì)胞系。⑶根據(jù)Rab11-FIP4基因序列構(gòu)造sgRNA，構(gòu)造GV371-Rab11-FIP4-sgRNA質(zhì)粒，通過CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)敲除PANC

8、-1細(xì)胞中Rab11-FIP4基因，熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染效率，Cruise酶切法檢測(cè)Rab11-FIP4敲除效率。⑷通過MTT方法分析細(xì)胞增殖能力，PI染色法檢驗(yàn)細(xì)胞周期，Annexin V-APC單染法分析細(xì)胞凋亡情況，transwell實(shí)驗(yàn)和 Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力。⑸單因素方差分析比較各組均數(shù)，卡方檢驗(yàn)或者 Fisher確切概率法比較Rab11-FIP4與臨床病理資料之間的關(guān)系，Kaplan-Meier

9、評(píng)估總體生存情況。
　　結(jié)果：
　　①胰腺癌組織中Rab11-FIP4表達(dá)顯著多于癌旁正常組織（P=0.0001）。Rab11-FIP4高表達(dá)與腫瘤大小(P=0.0001)，病理分級(jí)(P=0.028)，淋巴轉(zhuǎn)移(P=0.001)和TNM分期(P=0.004)顯著相關(guān)，但與年齡(P=0.832)，性別（P=0.228）和腫瘤大小(P=0.875)無(wú)關(guān)。并且， Kaplan-Meier生存分析顯示Rab11-FIP4高表達(dá)與總生

10、存期顯著相關(guān)（P=0.0036）。②CFPAC-1, PANC-1和AsPC-1中Rab11-FIP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為4.065±0.176，15.368±0.132,21.556±0.006，選擇PANC-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。③Cruise酶切法結(jié)果提示CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)能夠有效地敲除PANC-1細(xì)胞中Rab11-FIP4基因。④Rab11-FIP4敲除細(xì)胞增殖能力下降，抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，降低細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力，