SOX4在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　黑素瘤是來源于黑素細(xì)胞的具有高度侵襲性的皮膚惡性腫瘤，早期診斷并行手術(shù)切除的黑素瘤預(yù)后良好，而中晚期黑素瘤預(yù)后差，致死率高，嚴(yán)重危害我國人民健康及生活質(zhì)量。目前已發(fā)現(xiàn)黑素瘤是多因素、多階段、多種分子事件共同作用導(dǎo)致的惡性疾病，其中異?；钚缘霓D(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控下游靶基因而引起細(xì)胞下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，繼發(fā)性影響細(xì)胞增殖與凋亡，侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，最終造成黑素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。然而現(xiàn)有的分子機(jī)制研究尚不足以十分明晰黑

2、素瘤發(fā)生發(fā)展乃至侵襲轉(zhuǎn)移的具體機(jī)理。因此，探索黑素瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化應(yīng)用于疾病的預(yù)防與治療，對降低黑素瘤患者死亡率和改善黑素瘤患者預(yù)后具有顯著意義。
　　SOX家族為一類調(diào)控組織特異性、器官發(fā)育、細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過轉(zhuǎn)錄水平激活或抑制下游基因及通路，參與并調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移行為。SOX4屬于SOX C亞家族成員，不僅在維持細(xì)胞干性，促進(jìn)骨及神經(jīng)組織正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用，還

3、在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)且與腫瘤患者的預(yù)后及生存期相關(guān)。越來越多的研究顯示，SOX4可以通過影響細(xì)胞增殖，周期，凋亡等過程參與乳腺癌，肝癌，結(jié)腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并且有針對SOX4的T細(xì)胞及抗體表位肽研究應(yīng)用于肺癌的疫苗研制，靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子SOX4的表達(dá)及調(diào)節(jié)其觸發(fā)的相關(guān)免疫反應(yīng)可有效地抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。這強(qiáng)烈提示SOX4具有成為免疫疫苗靶點(diǎn)及治療腫瘤疾病靶點(diǎn)的巨大潛力。然而，SOX4與其調(diào)控的下游靶基因及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在黑素瘤

4、發(fā)生發(fā)展中的詳盡作用及具體機(jī)制尚不明確。闡明SOX4在黑素瘤發(fā)病機(jī)制中的具體作用，并探討挖掘其治療潛能，可為靶向治療黑素瘤及研制黑素瘤疫苗提供理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本課題擬通過檢測轉(zhuǎn)錄因子SOX4在轉(zhuǎn)移性黑素瘤，原發(fā)黑素瘤，色素痣以及黑素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并從分子生物學(xué)水平研究轉(zhuǎn)錄因子SOX4對黑素瘤增殖，侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響，進(jìn)而闡明SOX4在黑素瘤發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和具體機(jī)制，為黑素瘤臨床診療及預(yù)后提供重要的理

5、論依據(jù)。
　　方法：
　　1.Real-time PCR法，western blot方法檢測轉(zhuǎn)錄因子SOX4在色素痣，原發(fā)黑素瘤和轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的表達(dá)情況。
　　2.Western blot方法檢測惡性黑素瘤細(xì)胞系中SOX4在蛋白水平的表達(dá)。
　　3.使用轉(zhuǎn)染試劑將特異靶向SOX4的siRNA轉(zhuǎn)入黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058，WM35中，降低細(xì)胞內(nèi)源性SOX4的表達(dá)水平。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡水平

6、以觀察轉(zhuǎn)錄因子SOX4對轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響。
　　5.建立SOX4慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，real-time PCR及western blot方法檢測SOX4水平是否下調(diào)，以此判斷細(xì)胞系是否建立成功。為下一步深入機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
　　6.在成功建立的SOX4低表達(dá)的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中，對EMT的標(biāo)志物E-cadherin進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　　1.SOX4在黑素瘤組織和黑素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)
　　

7、在RNA水平上，轉(zhuǎn)錄因子SOX4在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中的表達(dá)水平顯著高于原發(fā)黑素瘤及色素痣，原發(fā)黑素瘤與色素痣中SOX4的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。色素痣中p53的表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)移性黑素瘤和原發(fā)黑素瘤。Real-time PCR顯示相對瘤旁組織，瘤中心組織的SOX4水平明顯升高。Western blot法檢測顯示在蛋白水平上，原發(fā)黑素瘤及轉(zhuǎn)移性黑素瘤的SOX4表達(dá)水平高于色素痣組織，同時多個黑素瘤細(xì)胞系都檢測到了轉(zhuǎn)錄因子SOX4的表達(dá)，且A2

8、058及WM35細(xì)胞系中的表達(dá)量最為突出，于是選取此兩種細(xì)胞系作為下一步檢測生物學(xué)行為的實(shí)驗(yàn)對象。
　　2.SOX4對黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　瞬時轉(zhuǎn)染SOX4 siRNA后的黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058及WM35，相比對照組，SOX4表達(dá)水平降低，同時黑素瘤細(xì)胞的生長速度減慢，Gl期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例減少，細(xì)胞凋亡指數(shù)增加。
　　3.成功構(gòu)建SOX4的慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)A2058細(xì)胞系，在蛋白及mRNA水平上驗(yàn)證了SOX4的

9、下調(diào)表達(dá)。
　　4．成功建立慢病毒轉(zhuǎn)染A2058細(xì)胞系，western blot檢測顯示，當(dāng)SOX4水平降低時，E-cadherin表達(dá)水平下降。
　　結(jié)論：
　　1.本研究通過檢測發(fā)現(xiàn)，在mRNA水平上，轉(zhuǎn)錄因子SOX4在黑素瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于原發(fā)黑素瘤組織和色素痣組織，但原發(fā)黑素瘤組織與色素痣組織之間無明顯差異。在蛋白水平上，轉(zhuǎn)錄因子SOX4在轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織和原發(fā)性黑素瘤組織中的表達(dá)水平均明顯高于色素痣組

10、織。得出結(jié)論，SOX4參與黑素瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。
　　2.通過黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058及WM35瞬時轉(zhuǎn)染SOX4 siRNA的實(shí)驗(yàn)，在mRNA及蛋白水平上證實(shí)SOX4表達(dá)水平降低后，進(jìn)行細(xì)胞流式實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：相比陰性對照組，SOX4 siRNA組的黑素瘤細(xì)胞生長速度減慢，Gl期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例減少，細(xì)胞凋亡指數(shù)增加。這說明轉(zhuǎn)錄因子SOX4可以抑制黑素瘤細(xì)胞的凋亡，使Gl期進(jìn)入S期的細(xì)胞比例增加，加強(qiáng)黑素瘤細(xì)胞的增殖能力。<