突變型HBx在HCC發(fā)生發(fā)展中的致癌作用及機(jī)制研究.pdf

1、[研究背景]全球范圍內(nèi)有超過2.4億人發(fā)生慢性乙肝的感染，每年約有60萬人因?yàn)镠BV感染所致肝病死亡。在亞洲及撒哈拉以南的非洲地區(qū)，因?yàn)镠BV感染的流行，HCC發(fā)生明顯高于其他地區(qū)。HCC發(fā)生最為相關(guān)的危險(xiǎn)因素就是HBV感染，HBx蛋白作為HBV編碼的最小蛋白，具有反式激活因子功能，可以通過蛋白與蛋白之間的相互作用，刺激病毒復(fù)制或改變宿主基因的表達(dá)，從而促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展。由于HBV病毒在復(fù)制過程中缺乏校正功能，所以HBV基因常常發(fā)生突

2、變。HCC病人就經(jīng)常發(fā)現(xiàn)HBx基因突變，并且HBx基因的突變?cè)贖CC發(fā)生發(fā)展的過程中是逐漸累積的。與HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的常見HBx突變有G1613A、C1653T、T1674C/G、T1753V、T1768A以及A1762T/G1764A雙突變。轉(zhuǎn)染含有這些突變的HBx質(zhì)粒可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖遷移能力。然而目前的研究都是從單一的分子或是信號(hào)通路著手，利用生物信息學(xué)的方法，從促炎促癌信號(hào)網(wǎng)絡(luò)解釋HBx基因突變是如何促進(jìn)肝癌發(fā)生的研究目前還十

3、分缺乏。
　　[研究目的]本研究利用生物信息學(xué)的方法，以炎癥信號(hào)網(wǎng)絡(luò)為著手點(diǎn)，研究HBx基因突變是如何通過改變炎癥或是促癌信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來促進(jìn)HCC發(fā)生發(fā)展的。為尋找HBV-HCC診斷和治療新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　[研究方法]首先通過PCR的方法，以HCC病人血清中提取的HBV DNA為模板擴(kuò)增HBx基因片段，并構(gòu)建相應(yīng)的慢病毒及睡美人轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒。其中包括野生型、突變型以及C端截短型的HBx。利用慢病毒載體及睡美人轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，在肝癌

4、HepG2細(xì)胞及睡美人小鼠中成功表達(dá)HBx蛋白。通過檢測(cè)HepG2細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，明確突變型HBx在肝癌細(xì)胞內(nèi)的致癌能力;通過檢測(cè)小鼠生癌及炎癥因子表達(dá)情況，明確突變型HBx在動(dòng)物體內(nèi)的促炎、促癌能力。其次，分析HTA2.0芯片信噪比富集GSEA基因項(xiàng)，對(duì)富集到的基因繪制蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，在最致密的蛋白-蛋白相互作用模塊中尋找突變型HBx與野生型HBx相比差異較大的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子。緊接著在HTA2.0及Agilent芯片

5、中，通過突變型HBx與野生型HBx比較得到的差異基因富集GSEA基因項(xiàng)，并找到HTA2.0及Agilent芯片中共有的基因項(xiàng)，從而尋找HBx基因突變?cè)隗w內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中共同改變的促炎促癌信號(hào)通路。最后在細(xì)胞及小鼠體內(nèi)驗(yàn)證候選的炎癥信號(hào)通路及關(guān)鍵調(diào)控分子，找到HBx突變調(diào)控的關(guān)鍵基因。
　　[研究結(jié)果]1.通過PCR的方法，以病人血清中提取的HBV DNA為模板，擴(kuò)增突變型、C端截短型及野生型HBx片段并構(gòu)建到慢病毒及睡美人轉(zhuǎn)座子中，各種

6、突變型HBx片段涉及到的HCC及肝硬化相關(guān)突變?nèi)缦?
　　M1突變型:A1727G+A1762T/G1764A;
　　M2突變型:T1753A+ A1762T/G1764A;
　　M3突變型:A1762T/G1764A;
　　M4突變型:C1653T+T1674G+A1762T/G1764A
　　C端截短型:nt.1733位點(diǎn)G→A突變，原密碼子由TGG變?yōu)榻K止密碼子TGA從而發(fā)生截短。
　　首先，通

7、過慢病毒系統(tǒng)成功在HepG2細(xì)胞中表達(dá)各種突變型、C端截短型以及野生型HBx蛋白。其次，通過細(xì)胞周期、增殖、遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生型HBx相比，突變型HBx可以加速細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖。表達(dá)M3、M4、Ct型HBx的HepG2細(xì)胞處于S期的比例要高于表達(dá)野生型HBx的細(xì)胞（p值分別為0.016，0.006以及0.024）。表達(dá)M4突變型HBx的HepG2細(xì)胞增殖能力明顯比表達(dá)野生型HBx以及空載體組的細(xì)胞要高（p值分別為＜0.

8、001和0.001）。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，M4突變型組裸鼠皮下腫瘤重量要明顯高于野生型組(p=0.039)。
　　2.利用睡美人轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在睡美人小鼠肝臟中成功表達(dá)突變型、C端截短型以及野生型HBx蛋白。統(tǒng)計(jì)小鼠肝臟生瘤情況發(fā)現(xiàn)，突變型、C端截短型組小鼠的生瘤率及生瘤大小要普遍高于野生型組。M4突變及C端截短型組生瘤率顯著高于野生型、空載體組（M4 vs.Wt，p=0.010; M4 vs.Vector，p＜0.001;Ct vs

9、.Vector，p=0.019）。突變型組小鼠的腫瘤與肝臟重量比值要高于野生型及空載體組，其中M4突變型組顯著高于野生型及空載體組（p值分別為0.012和0.005）。同時(shí)，檢測(cè)小鼠血清炎癥因子的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)M4突變型組IL-6表達(dá)水平要顯著高于空載體組(p=0.024);M4突變型組IL-5表達(dá)水平要顯著高于野生型及空載體組（p值分別為0.010和0.043）;M4突變型組IFN-γ的表達(dá)水平要顯著高于野生型及空載體組(p值分別為0

10、.029和0.005);突變型組中，IL-1β、IL-12p70、IFN-α以及IL-4的檢出率均高于野生型或空載體組。
　　3.HTA2.0芯片通過信噪比富集GSEA基因項(xiàng)并繪制蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過突變型HBx與野生型HBx組相比，在最致密的蛋白-蛋白相互作用模塊中尋找差異關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子:CDC20、PAI-1等。利用HTA2.0及Agilent芯片差異基因富集GSEA基因集，并找到共同富集到的GSEA基因項(xiàng)，其中包括IL

11、-6炎癥信號(hào)通路及部分癌癥相關(guān)信號(hào)通路。
　　4.通過RT-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞中，突變型及C端截短型組CDC20mRNA水平顯著高于野生型組(M3 vs.Wt，p=0.026; M4 vs.Wt，p＜0.001;Ct vs.Wt，p＜0.001);PAI-1 mRNA水平也具有相同的結(jié)果(M4 vs.Wt，p=0.001;Ct vs.Wt，p＜0.001)。蛋白水平檢測(cè)明確了突變型HBx較野生型HBx上調(diào)CDC20、P

12、AI-1基因的表達(dá)的能力更強(qiáng);這在小鼠肝臟免疫組化結(jié)果中同樣被證實(shí)。小鼠炎癥因子檢測(cè)則明確了M4突變型組IL-6表達(dá)水平顯著高于野生型組或空載體組（p值分別為0.083和0.024）。以上結(jié)果證明了與野生型HBx相比，突變型HBx更能促進(jìn)IL-6通路的激活以及CDC20和PAI-1基因的表達(dá)。
　　5.M4突變型HBx較野生型HBx能夠顯著提高HepG2細(xì)胞的增殖能力，當(dāng)敲低CDC20或PAI-1基因表達(dá)后，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染含有M4突變型