低密度粒細胞在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用及機制研究.pdf

1、研究目的：
　　1、通過比較健康人與TB患者、不同嚴重程度的TB患者、治療前后的TB患者外周血LDGs的水平，明確LDGs水平與TB的相關(guān)性。
　　2、分析LDGs及NDGs的分子表型及凋亡、活化水平，探討LDGs的分化狀態(tài)。
　　3、通過體外感染實驗驗證Mtb感染與LDGs產(chǎn)生的相關(guān)性及LDGs的來源。
　　4、通過體外實驗探討LDGs形成的相關(guān)機制。
　　5、通過吞噬和殺菌實驗，初步探討LDGs在抗Mt

2、b感染中的作用。
　　研究方法：
　　1、分別收集健康人和TB患者外周血標本，進一步將TB患者按痰涂片抗酸染色結(jié)果分為抗酸陽性、陰性兩組，按抗結(jié)核藥物治療時間分為治療前、治療2周、治療6月三組，流式細胞術(shù)分析外周血PBMC層中LDGs的比例。
　　2、LDGs及NDGs分子表型及凋亡、活化水平檢測：流式細胞術(shù)檢測LDGs表面CD15、CD16、CD33、CD66b、CD62L的表達水平及凋亡壞死率、ROS水平。

3、　　3、Mtb感染與LDGs產(chǎn)生的相關(guān)性驗證及LDGs的來源探討：（1）采用H37Rv以不同感染比例感染健康人外周血，于不同的時間點采用流式細胞術(shù)檢測LDGs占PBMC層的比例；（2）采用不同毒力的分枝桿菌感染健康人外周血，采用流式細胞術(shù)檢測LDGs占PBMC層的比例；（3）分離純化健康人外周血中性粒細胞，以H37Rv按不同感染比例感染中性粒細胞,4h后采用Ficoll密度梯度離心法分離LDGs和NDGs,牛鮑計數(shù)板分別計數(shù)后，計算LD

4、Gs占總中性粒細胞的比例。
　　4、從凋亡水平探討LDGs的形成機制：分別在不干預和凋亡抑制條件下采用H37Rv感染健康人外周血，分別作用T=4h、15h后檢測LDGs產(chǎn)生的水平。
　　5、從ROS水平探討LDGs的形成機制：分別在ROS促進（PMA處理）和ROS抑制（NAC處理）條件下采用H37Rv感染健康人外周血，探討ROS對LDGs產(chǎn)生的影響。
　　6、LDGs的功能探討：（1）采用流式細胞術(shù)對比TB患者外周血L

5、DGs和NDGs對Mtb的吞噬能力，以及體外誘導形成的LDGs和NDGs的吞噬功能。（2）采用H37Rv分別感染LDGs和NDGs，于不同的時間點裂解細胞進行H37Rv的培養(yǎng)、計數(shù)，探討LDGs和NDGs對H37Rv的殺菌功能。
　　研究結(jié)果：
　　1、TB患者外周血中LDGs的比例顯著高于健康對照組；痰涂片抗酸陽性的TB患者LDGs的比例顯著高于抗酸陰性者；TB患者經(jīng)抗癆治療后，外周血LDGs的比例隨治療時間延長而下降，治

6、療兩周后，LDGs的比例顯著降低，治療6個月后與健康對照組無明顯差異。
　　2、與NDGs相比，TB患者LDGs表面CD15、CD33、CD66b表達量顯著升高，CD62L的表達量顯著下降，凋亡率上調(diào)，ROS水平上調(diào)。
　　3、體外分枝桿菌感染可顯著上調(diào)健康人外周血中LDGs的水平。分枝桿菌誘導LDGs生成的能力具有時間和感染劑量依賴性，并與分枝桿菌的毒力和活力相關(guān)。采用Mtb感染健康人外周血中純化成熟中性粒細胞同樣能誘導L

7、DGs的生成。
　　4、中性粒細胞的凋亡水平與LDGs生成比例無直接相關(guān)性。
　　5、采用PMA上調(diào)中性粒細胞的ROS水平可顯著上調(diào)LDGs的生成水平，相反，采用NAC抑制中性粒細胞的ROS水平則顯著下調(diào)Mtb感染后LDGs的生成水平。
　　6、與NDGs比較，LDGs吞噬功能增強，殺菌功能無明顯差異。
　　研究結(jié)論：
　　1、LDGs水平在TB患者外周血中顯著上調(diào)，且與TB的嚴重程度相關(guān)；
　　2、