藍(lán)斑核去甲腎上腺素在帕金森病發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1）確定炎癥介導(dǎo)的嚙齒動(dòng)物PD模型中是否發(fā)生自下而上、有序的漸進(jìn)性神經(jīng)元的缺失，尤其是藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元;2）確定較早發(fā)生的藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元死亡和去甲腎上腺素缺失是否與其投射區(qū)的神經(jīng)元變性死亡有關(guān);3）建立一個(gè)合適的帕金森病模型能夠同時(shí)出現(xiàn)帕金森病的運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)癥狀;4）闡明藍(lán)斑核去甲腎上腺素如何調(diào)節(jié)炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)退行性病變的機(jī)制。5）根據(jù)以上研究結(jié)果，發(fā)展新的帕金森病靶向治療方案。
　　方法：

2、
　　1.小鼠動(dòng)物模型:根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，6-8周齡雄性C57BL/6小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg.bw)或DSP-4(50 mg/kg.bw)或先后聯(lián)合注射。在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)（分別在注射之后的第1,2,4,7,10，12個(gè)月），從各組取5-8只小鼠實(shí)施安樂(lè)死，并取出大腦后固定在4％多聚甲醛中4℃過(guò)夜。然后大腦置于30％蔗糖/PBS溶液中4℃保存，直至大腦下沉到容器的底部。作冠狀切面冰凍切片，收集含藍(lán)斑核的腦干，含

3、黑質(zhì)、海馬的中腦，以及大腦皮質(zhì)區(qū)的35μm厚度組織切片。
　　2.免疫組織化學(xué)染色:用4-10％山羊血清和1％ BSA在triton-100/PBS溶液中封閉，然后與多克隆兔抗TH抗體（1∶2000-5000稀釋），或NeuN抗體（1∶1000稀釋度）4℃下作用48小時(shí)。使用Vectastain ABC試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺基染色顯示細(xì)胞或免疫熒光染色共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和病理改變。
　　結(jié)果：
　　1.LPS注射引

4、起小鼠自腦干至皮質(zhì)，自下而上發(fā)生有序的、漸進(jìn)性的神經(jīng)元變性死亡。
　　1.1 在LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性帕金森病小鼠模型中，藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元減少早于黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元減少3-4個(gè)月。
　　單次腹腔注射LPS在C57BL/6小鼠后，藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元最先發(fā)生減少，4個(gè)月注射LPS后LC-NE神經(jīng)元損失達(dá)30％，神經(jīng)元減少持續(xù)進(jìn)行，10個(gè)月可達(dá)52％。隨后，中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元在第7個(gè)月時(shí)發(fā)生明顯減少，1

5、0個(gè)月時(shí)減少32％。同樣的結(jié)果在人類A53T轉(zhuǎn)基因小鼠中得以證實(shí)。A53T轉(zhuǎn)基因小鼠在LPS腹腔注射1個(gè)月即發(fā)生藍(lán)斑核神經(jīng)元損失，而多巴胺神經(jīng)元損失發(fā)生在3個(gè)月以后。這符合帕金森病人實(shí)際中發(fā)生的，循序漸進(jìn)性神經(jīng)元的變性死亡規(guī)律。
　　1.2 由LPS注射引起小鼠自腦干至皮質(zhì)，自下而上發(fā)生的有序的、漸進(jìn)性的神經(jīng)元變性死亡。
　　單次腹腔注射LPS在C57BL/6小鼠后，繼藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元最先發(fā)生減少和中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺

6、能神經(jīng)元減少之后，10個(gè)月時(shí)，中腦以上的海馬、皮質(zhì)區(qū)也相繼發(fā)生神經(jīng)元的變性死亡。總之，我們研究結(jié)果證明，炎癥介導(dǎo)的小鼠帕金森病模型可以模擬帕金森病人表現(xiàn)出的自下而上，從腦干到皮質(zhì)的神經(jīng)元漸進(jìn)性退行性變的病理改變過(guò)程。
　　2.藍(lán)斑核-去甲腎上腺素耗竭促進(jìn)腎上腺素能神經(jīng)元投射區(qū)神經(jīng)元的退行性變和死亡。
　　2.1 藍(lán)斑核-去甲腎上腺素耗竭引起投射區(qū)發(fā)生自下而上有序、漸進(jìn)性神經(jīng)元退行性變。
　　藍(lán)斑核-去甲腎上腺素由DSP

7、-4注射耗盡后，首先在黑質(zhì)致密部發(fā)現(xiàn)了延遲性和進(jìn)展性的多巴胺能神經(jīng)元減少，4個(gè)月時(shí)減少32.4％，這種減少持續(xù)發(fā)展，到第10個(gè)月時(shí)減少49.9％。另外，通過(guò)DSP-4誘導(dǎo)的神經(jīng)變性隨后也延伸到皮質(zhì)和海馬。NeuN免疫組織化學(xué)染色顯示，在DSP-4給予第10個(gè)月時(shí)，海馬和皮質(zhì)的神經(jīng)元減少分別達(dá)到30.0％和27.7％。值得注意的是，對(duì)于沒(méi)有去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射的尾殼核進(jìn)行免疫染色觀察神經(jīng)元是否受到影響，發(fā)現(xiàn)整個(gè)過(guò)程直至第10個(gè)月時(shí)，該

8、區(qū)域的神經(jīng)元穩(wěn)定存在，未受DSP-4耗竭去甲腎上腺素的影響。
　　2.2 由DSP-4注射引起的去甲腎上腺素耗竭促使藍(lán)斑核去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生持續(xù)活化。
　　為了探索去甲腎上腺素耗竭引起投射區(qū)神經(jīng)元變性死亡的原因，我們分別使用Iba-1和CD11b兩個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞胞漿和胞膜的特異性標(biāo)志物抗體檢測(cè)去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射區(qū)（包括黑質(zhì)、海馬、皮質(zhì)）小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況。結(jié)果顯示，在所有這些去甲腎上腺素能神經(jīng)支配

9、的大腦區(qū)域，在DSP-4給予后的第7天時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞即表現(xiàn)出明顯活化特征，包括阿米巴樣肥大形態(tài)和Iba1、CD11b染色加深、表達(dá)升高，并且小膠質(zhì)細(xì)胞的這些激活狀態(tài)一直持續(xù)至第10個(gè)月。DSP-4處理導(dǎo)致的黑質(zhì)、海馬(DG區(qū))、皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，表現(xiàn)為CD11b染色密度的升高，以密度定量，與對(duì)照相比，第7天時(shí)，可增高至153.5％至193.8％，10個(gè)月時(shí)，升高至～250％。與此不同，對(duì)于沒(méi)有去甲腎上腺素能神經(jīng)元投射的尾殼核進(jìn)行免疫

10、染色觀察小膠質(zhì)細(xì)胞是否受到影響，發(fā)現(xiàn)整個(gè)過(guò)程直至第10個(gè)月時(shí)，該區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞并無(wú)激活改變，未受DSP-4耗竭去甲腎上腺素的影響。
　　3.去甲腎上腺素耗竭促進(jìn)LPS炎性介導(dǎo)的帕金森病小鼠模型同時(shí)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)和非運(yùn)動(dòng)行為學(xué)改變。
　　3.1 提前注射DSP-4促使去甲腎上腺素耗竭導(dǎo)致LPS炎性帕金森病模型中，黑質(zhì)、海馬和皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元變性和死亡增多。
　　提前一周給予DSP-4注射以耗竭藍(lán)斑核去加腎上腺素的合成，再給予LP

11、S引起帕金森病炎性模型，可發(fā)現(xiàn)，在注射12月以后，與單獨(dú)給予LPS的組別相比，DSP-4和LPS雙重打擊可增加藍(lán)斑核投射區(qū)神經(jīng)元的變性死亡（包括黑質(zhì)、海馬、皮質(zhì)區(qū)）。
　　3.2 去甲腎上腺素提前耗竭促使LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)炎性帕金森病模型中出現(xiàn)多種符合帕金森病人中運(yùn)動(dòng)癥狀出現(xiàn)之前的多種非運(yùn)動(dòng)癥狀。
　　與鹽水對(duì)照或LPS單獨(dú)給予組相比，DSP-4和LPS雙重打擊可以誘導(dǎo)小鼠帕金森病炎性模型中出現(xiàn)多種類似帕金森病人運(yùn)動(dòng)前癥狀的行

12、為學(xué)改變，包括埋藏食物探索實(shí)驗(yàn)得出的嗅覺(jué)減退，梯形十字架迷宮實(shí)驗(yàn)得出的焦慮抑郁癥狀，一小時(shí)糞便試驗(yàn)中表現(xiàn)出的便秘胃腸功能紊亂等。
　　4.突觸外旁分泌的低濃度去甲腎上腺素通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞免疫活性發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。
　　4.1 在原代培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)混合培養(yǎng)體系中，亞微摩爾濃度水平去甲腎上腺素保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。
　　[3H]多巴胺攝取試驗(yàn)表明，去甲腎上腺素預(yù)處理可以重塑多巴胺能神經(jīng)元的

13、功能，并在10-6-10-9濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。多巴胺能神經(jīng)元經(jīng)THIR抗體免疫組織化學(xué)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果進(jìn)一步證明，去甲腎上腺素預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元毒性損傷和數(shù)量減少，在10-6-10-9濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。除了恢復(fù)多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量，NE減少了炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)毒性相關(guān)的多巴胺能神經(jīng)突起退縮和退化。兩者合計(jì)表明，去甲腎上腺素對(duì)LPS誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用。
　　4.2 小膠質(zhì)細(xì)胞在

14、低濃度去甲腎上腺素保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受炎性損傷中必不可少。
　　在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系中，NE(10-7 M)有效逆轉(zhuǎn)MPP+誘導(dǎo)的[3H] DA攝取減少，可恢復(fù)20％，但當(dāng)去除該體系中的小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，這一保護(hù)作用消失。這表明，去甲腎上腺素介導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)保護(hù)需要小膠質(zhì)細(xì)胞的存在，提示去甲腎上腺素可能是通過(guò)抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活而發(fā)揮作用。
　　5.氯氮平代謝產(chǎn)物（CNO和NDC）通過(guò)作用于小膠質(zhì)細(xì)胞NOX2抑制其

15、活化保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受炎性損傷。
　　5.1 在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)體系中，氯氮平代謝產(chǎn)物（CNO和NDC）保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損傷。
　　CNO或NDC預(yù)處理保護(hù)多巴胺神經(jīng)元免受LPS誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為對(duì)[3H]多巴胺攝取能力的重塑和降低多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量的減少，并呈現(xiàn)凸形劑量反應(yīng)關(guān)系。CNO和NDC最有效的濃度分別為0.01μm和0.1μm。
　　5.2 小膠質(zhì)細(xì)胞在CNO和NDC的神

16、經(jīng)保護(hù)作用中至關(guān)重要。
　　在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的完全混合培養(yǎng)體系中，CNO和NDC都對(duì)神經(jīng)炎性誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷具有明顯的保護(hù)作用，但當(dāng)在培養(yǎng)體系中撤除小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，這些保護(hù)作用也隨之消失，說(shuō)明小膠質(zhì)細(xì)胞是CNO和NDC發(fā)揮有效神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)細(xì)胞。對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)特異性抗體Iba-1和CD11b染色和Western bot定量結(jié)果表明，CNO和NDC可以有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。進(jìn)一步對(duì)TNF-α和NO等炎性因子的

17、檢測(cè)表明，CNO和NDC可以有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化產(chǎn)生的炎性因子的釋放。
　　結(jié)論：
　　1.在炎性介導(dǎo)的小鼠帕金森病模型中，藍(lán)斑核的去甲腎上腺素能神經(jīng)元減少相比黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的減少要早3-4個(gè)月。
　　2.藍(lán)斑核去甲腎上腺素耗竭引起大腦中腎上腺素能神經(jīng)元投射區(qū)神經(jīng)元發(fā)生自下而上有序的、漸進(jìn)性、慢性進(jìn)行性神經(jīng)退行性變。
　　3.較早發(fā)生的藍(lán)斑核去甲腎上腺素耗竭促使炎性介導(dǎo)的帕金森病小鼠模型中出現(xiàn)帕金森病