去甲腎上腺素對(duì)腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核神經(jīng)元活動(dòng)的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、中樞去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)能系統(tǒng)在多種重要的生理功能中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。腦干中的藍(lán)斑核(locus coeruleus，LC)是中樞NA的主要來(lái)源。盡管NA能神經(jīng)元的分布主要位于腦干當(dāng)中，但由這些神經(jīng)元所發(fā)出的纖維廣泛投射至包括脊髓在內(nèi)的整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在中樞的不同腦區(qū)當(dāng)中，主要存在三種受體，包括α1、α2以及β受體，介導(dǎo)了NA對(duì)不同腦區(qū)神經(jīng)元活動(dòng)及相關(guān)功能的調(diào)控。然而，鑒于其受體種類(lèi)繁多，并且分布模式以

2、及激活后對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)的影響均呈現(xiàn)出多樣性，NA參與不同生理功能的細(xì)胞分子機(jī)制也十分復(fù)雜多樣，并因此引起了廣泛的關(guān)注。
　　腦橋尾側(cè)網(wǎng)狀核(caudal pontine reticular nucleus，PnC)是mPMRF的重要組成部分，PnC中的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元介導(dǎo)了震驚運(yùn)動(dòng)(startle)這一姿勢(shì)調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)。已有研究表明，在PnC中微量注射N(xiāo)A可以對(duì)大鼠震驚反射運(yùn)動(dòng)行為的幅度產(chǎn)生顯著的調(diào)節(jié)作用，據(jù)此我們推測(cè)NA可能通過(guò)調(diào)控Pn

3、C網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元，參與其介導(dǎo)的中樞運(yùn)動(dòng)功能調(diào)節(jié)?；仡櫸墨I(xiàn)，目前尚無(wú)NA對(duì)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)控機(jī)制的報(bào)道。因此，本文綜合采用形態(tài)學(xué)、全細(xì)胞膜片鉗以及神經(jīng)藥理學(xué)技術(shù)，在細(xì)胞水平系統(tǒng)探索了NA對(duì)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的調(diào)控及機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1.α1以及α2受體共表達(dá)于單個(gè)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中，其激活共同介導(dǎo)了NA對(duì)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元全細(xì)胞電流活動(dòng)的影響。
　　為了明確NA作用于PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的電生理效應(yīng)，

4、我們將其鉗制在-70 mV，觀察短暫(3 min)灌流3μM的NA引起的全細(xì)胞電流變化。研究結(jié)果表明，NA(3μM)在一部分PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中誘發(fā)內(nèi)向電流反應(yīng)(82/135例，60.7％)，而在另一部分PnC神經(jīng)元中誘發(fā)外向電流反應(yīng)(53/135例，39.3％)。無(wú)論是NA誘發(fā)的內(nèi)向(P=0.364，n=6)還是外向(P=0.511，n=6)電流反應(yīng)，均不受TTX(1μM)的影響，提示突觸后的NA能受體介導(dǎo)了NA的效應(yīng)。結(jié)合藥理學(xué)手

5、段研究后發(fā)現(xiàn)，NA所誘發(fā)的內(nèi)向電流反應(yīng)可以被低濃度α1受體阻斷劑prazosin(Pra，0.01μM)部分阻斷(P＜0.05，n=7)，但高濃度的Pra(10μM)使NA在同一神經(jīng)元中反轉(zhuǎn)為引起內(nèi)向外向電流反應(yīng)。只有同時(shí)加入Pra(10μM)以及α2受體阻斷劑yohimbine(Yh，10μM)方可完全阻斷NA(3μM)對(duì)該神經(jīng)元全細(xì)胞電流的影響(P＜0.01，n=7)。應(yīng)用同樣方法研究后發(fā)現(xiàn)，NA所誘發(fā)的外向電流反應(yīng)可以被低濃度α2

6、受體阻斷劑Yh(0.01μM)部分阻斷(P＜0.01，n=6)，但高濃度的Yh(10μM)使NA在同一神經(jīng)元中反轉(zhuǎn)為引起內(nèi)向電流反應(yīng)。只有同時(shí)加入Pra(10μM)以及Yh(10μM)方可完全阻斷NA(3μM)對(duì)該神經(jīng)元全細(xì)胞電流的影響(P＜0.01，n=6)。上述結(jié)果表明，PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后共表達(dá)有α1和α2受體，其激活在電壓鉗鉗制于-70 mV的PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中分別介導(dǎo)了內(nèi)向和外向電流成分，兩者經(jīng)過(guò)不同整合后，表現(xiàn)為N

7、A在一部分神經(jīng)元誘發(fā)內(nèi)向電流，而在另一部分誘發(fā)外向電流。與此相一致的是，免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果表明，α1A和α2A受體亞型共表達(dá)于PnC中胞體直徑大于35μm的網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元中。
　　2.突觸后α1和α2受體的激活，分別增加和抑制同一PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電活動(dòng)。
　　本實(shí)驗(yàn)中灌流的ACSF中加入了CNQX(10μM)、AP5(20μM)和picrotoxin(100μM)，以阻斷PnC中的主要興奮及抑制性突觸傳遞。在此基礎(chǔ)上，

8、我們于電流鉗模式(I=0)模式，直接記錄PnC網(wǎng)站脊髓神經(jīng)元的放電活動(dòng)。在該條件下，所有記錄的6例神經(jīng)元均表現(xiàn)出自發(fā)放電活動(dòng)(平均放電頻率:4.5±1.5 Hz;頻率變化范圍:1.7～11.6 Hz)。ACSF灌流α1受體的激動(dòng)劑phenylephrine(PE，100μM)顯著增加了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電頻率(P＜0.05;n=6);而在同一個(gè)的神經(jīng)元中，ACSF灌流α2受體的激動(dòng)劑則顯著降低了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的放電頻率(P＜

9、0.05;n=6)。該結(jié)果不僅進(jìn)一步確認(rèn)了實(shí)驗(yàn)室前期電壓鉗實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，更進(jìn)一步揭示了PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后α1以及α2受體的激活可以在神經(jīng)元活動(dòng)層次對(duì)神經(jīng)元興奮性分別起到相反的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用。
　　3.PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元突觸后α1和α2受體激活分別偶聯(lián)的離子通道機(jī)制。
　　在全細(xì)胞膜片鉗電壓鉗條件下，應(yīng)用緩慢的斜坡電壓(slowramp)刺激(-125 mV～+5mV，dV/dt=+10 mV/s)，我們可以得到α1以及

10、α2受體激動(dòng)劑在PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元上所誘導(dǎo)的凈電流的電流-電壓關(guān)系曲線(I-V relationship curve)。
　　(1)突觸后α1受體的激活，通過(guò)開(kāi)放下游非選擇性陽(yáng)離子通道調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動(dòng)。
　　通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PE(100μM)激活α1受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-29.1±3.0 mV;n=15)接近于文獻(xiàn)報(bào)道的非選擇性陽(yáng)離子通道電導(dǎo)(nonselective cationicco

11、nductance，NSCC)的平衡電位。并且在測(cè)試電壓范圍內(nèi)其I-V曲線均呈現(xiàn)出正向斜率，提示該通道開(kāi)放介導(dǎo)了α1受體激活對(duì)PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元的興奮性調(diào)控效應(yīng)。進(jìn)一步應(yīng)用離子置換實(shí)驗(yàn)降低胞外Na+濃度(由152.5 mM降至70 mM)不僅顯著降低了α1受體激活后引起的凈電流大小(P＜0.01;152.5 mM Na+:n=40;70 mM Na+:n=11)，α1受體激活所得到的凈電流的平衡電位也符合預(yù)期的向更負(fù)的方向移動(dòng)(-42

12、.9±4.2 mV;P＜0.05;152.5 mMNa+:n=15;70mMNa+: n=9)。上述結(jié)果表明，α1受體激活后可以激活NSCC，調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動(dòng)。文獻(xiàn)報(bào)道NSCC主要包含Na+以及K+成分，進(jìn)一步應(yīng)用翻轉(zhuǎn)電位以及戈德曼-霍奇金-卡茨方程(Goldman-Hodgkin-Katz equation)計(jì)算得出在不同胞外Na+濃度下的Na+/K+通透比例后發(fā)現(xiàn)，在兩種情況下其比例并無(wú)顯著差異(P=0.702;n=9)

13、。該結(jié)果表明，α1受體激活后可能僅與NSCC相偶聯(lián)。
　　(2)突觸后α2受體的激活，通過(guò)關(guān)閉非選擇性陽(yáng)離子通道和開(kāi)放K+通道調(diào)控PnC網(wǎng)狀脊髓神經(jīng)元活動(dòng)。
　　激活α2受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-23.5±4.3 mV;n=10)同樣接近于NSCC的平衡電位但略高于激活α1受體所得到的凈電流的平衡電位(mean:-29.1±3.0mV;n=15)。此外，在其中3列神經(jīng)元中，除接近于NSCC平衡電位的交點(diǎn)外，激

14、活α2受體所得到的凈電流同時(shí)還存在接近K+平衡電位的交點(diǎn)(mean:-99.3±4.3 mV)。該結(jié)果提示，與α1受體不同，α2受體下游可能同時(shí)偶聯(lián)了NSCC以及K+電導(dǎo)。進(jìn)一步的離子置換實(shí)驗(yàn)表明，胞外Na+濃度由152.5 mM降至70 mM顯著減弱了α2受體激活后所引起的凈電流幅度(P＜0.01;152.5 mM Na+:n=25;70 mM Na+:n=10)。與此同時(shí)，胞外Na+濃度由152.5 mM將至70 mM后，α2受體激

15、活后所引起的凈電流在絕大多數(shù)測(cè)試的神經(jīng)元(n=6/7)中均呈現(xiàn)出兩個(gè)平衡電位:-109.9±4.7 mV(依然接近于K+平衡電位，并且在低Na+條件下出現(xiàn)概率增大)和-28.2±1.0 mV(明顯高于低Na+條件下NSCC平衡電位的期待值，該期待值來(lái)自低Na+條件下α1受體激活后的平衡電位，-42.9±4.2mV)。值得注意的是，在剩下的1個(gè)神經(jīng)元中，α2受體激活后所引起的凈電流僅呈現(xiàn)出一個(gè)平衡電位，-44.0 mV，接近于低Na+條件

16、下NSCC平衡電位的期待值。該結(jié)果表明，α2受體激活偶聯(lián)了K+通道，并且K+通道的活動(dòng)可能顯著影響在低Na+(70 mM)條件NSCC平衡電位的觀測(cè)值，并使其向更正的方向移動(dòng)。的確，在ACSF中加入K+通道廣譜阻斷劑Ba2+后，α2受體激活后引起的凈電流幅度進(jìn)一步顯著減少(P＜0.05;70 mM Na+:n=10;1 mM Ba2+:n=6)，并且此時(shí)α2受體激活后引起的凈電流平衡電位僅存在一個(gè)，-44.7±1.3 mV(n=6)，與

17、上述低Na+條件下NSCC平衡電位的期待值也不在存在顯著差異(P=0.370)。該結(jié)果表明，α2受體激活后可以同時(shí)偶聯(lián)K+以及NSCC兩種電導(dǎo)。并且在阻斷鉀離子后計(jì)算α2受體偶聯(lián)NSCC的Na+/K+通透比與α1受體所偶聯(lián)NSCC的Na+/K+通透比并不存在顯著差異(P=0.671;α1:n=24;α2:n=6)，進(jìn)一步說(shuō)明兩者偶聯(lián)的為同一類(lèi)NSCC通道。對(duì)α2受體激活引起的凈電流I-V關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，其在接近K+平衡電位呈現(xiàn)出正向斜率而