尾加壓素Ⅱ?qū)π难芊瓷浼爸袠猩窠?jīng)元的調(diào)控作用.pdf

1、尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ，UⅡ)是20世紀(jì)80年代從魚(yú)的脊髓尾部下垂體中分離出來(lái)的一種“生長(zhǎng)抑素”樣環(huán)肽。研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)存在一種孤立的G蛋白偶聯(lián)受體(G-proteincoupledreceptor)GPR14，是UⅡ的特異性受體，主要分布于心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。UⅡ與心肌細(xì)胞上此受體結(jié)合后使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度增加，引起一系列的心血管效應(yīng)。UⅡ是迄今所知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，在兩棲類(lèi)動(dòng)物，引起動(dòng)脈條濃度依賴(lài)性收縮反應(yīng)；在哺乳類(lèi)動(dòng)物

2、，低濃度時(shí)可使動(dòng)脈條產(chǎn)生內(nèi)皮依賴(lài)性的松弛反應(yīng)，而高濃度時(shí)則引起動(dòng)脈條非內(nèi)皮依賴(lài)性收縮反應(yīng)。大劑量UⅡ除引起心動(dòng)過(guò)緩?fù)?，還引起持續(xù)的心輸出量減少。UⅡ除作用于心血管系統(tǒng)外，還具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和滲透壓的作用，并有促細(xì)胞增殖效應(yīng)。血漿中UⅡ的水平在高血壓、心衰、糖尿病、腎病等多種疾病狀態(tài)下有所升高。然而，有關(guān)UⅡ如何參與調(diào)節(jié)血壓的心血管反射，特別是對(duì)中樞神經(jīng)元的作用如何，目前仍不十分明確，本文主要通過(guò)在體和離體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，利用循環(huán)生理學(xué)、電生理

3、學(xué)、激光共聚焦顯微鏡、免疫組化等方法，從以下幾個(gè)方面進(jìn)行了研究：(1)采用隔離灌流頸動(dòng)脈竇區(qū)，記錄動(dòng)脈血壓變化的方法，觀察UⅡ?qū)⑴c調(diào)節(jié)血壓的重要的心血管反射——?jiǎng)用}壓力感受器反射的影響。(2)采用玻璃微電極細(xì)胞外記錄神經(jīng)元單位放電技術(shù)，觀察UⅡ?qū)Υ笫蠛ｑR腦片神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。(3)采用玻璃微電極細(xì)胞外記錄神經(jīng)元單位放電技術(shù)，觀察UⅡ?qū)Υ笫笙虑鹉X腦片室旁核神經(jīng)元自發(fā)放電的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。(4)采

4、用Fluo3-AM負(fù)載培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，用激光共聚焦法測(cè)定單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的熒光強(qiáng)度，觀察UⅡ?qū)ｑR神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響。(5)利用Fos蛋白免疫組化方法，研究側(cè)腦室注射UⅡ?qū)Υ笫笮难芟嚓P(guān)核團(tuán)中c-fos的表達(dá)的影響。 1尾加壓素Ⅱ?qū)Υ笫箢i動(dòng)脈壓力感受器反射的影響及其機(jī)制采用隔離灌流麻醉大鼠頸動(dòng)脈竇技術(shù)，觀察了尾加壓素Ⅱ?qū)︻i動(dòng)脈竇壓力感受器反射的影響。其結(jié)果如下：(1)UⅡ(30.

5、0，300.0，3000.0nmol/L)可以劑量依賴(lài)性地抑制大鼠頸動(dòng)脈竇壓力感受性反射，引起壓力感受性反射的功能曲線向右上方移動(dòng)，曲線斜率分別從0.43±0.01明顯下降到0.38±0.01(P＜0.01)，0.32±0.01(P＜0.01)，0.23±0.01(P＜0.01)，血壓反射性下降的幅度分別從44.00±1.03mmHg減小到37.67±1.21(P＜0.01)，32.50±1.05(P＜0.01),27.83±1.72(

6、P＜0.01)mmHg。閾壓分別從68.81±1.37mmHg升高到73.84±1.51(P＜0.01)，77.19±1.10(P＜0.01)，85.39±1.34(P＜0.01)mmHg；平衡壓上升，飽和壓升高。(2)預(yù)先應(yīng)用L型鈣通道的阻斷劑維拉帕米(10μmol/L)可以部分阻斷UⅡ?qū)?dòng)脈壓力感受器的抑制作用。(3)預(yù)先應(yīng)用UⅡ的受體阻斷劑BIM-23127(3.0μmol/L)可以完全阻斷UⅡ的作用。(4)預(yù)先灌流NO合酶阻斷劑

7、(NG-nitro-L-argininemethylester,L-NAME)100μmol/L，不能阻斷UⅡ?qū)?dòng)脈壓力感受器反射的抑制效應(yīng)。以上結(jié)果表明：UⅡ可以抑制頸動(dòng)脈竇壓力感受反射，此作用是UⅡ與平滑肌細(xì)胞膜上UⅡ的受體結(jié)合，通過(guò)開(kāi)放L型鈣通道引起頸動(dòng)脈竇區(qū)血管收縮而是實(shí)現(xiàn)的，與血管內(nèi)皮釋放的NO無(wú)關(guān)。 2尾加壓素Ⅱ?qū)Υ笫蠛ｑRCA1區(qū)神經(jīng)元放電的影響應(yīng)用細(xì)胞外記錄單位放電技術(shù)，在大鼠海馬腦片上觀察了UⅡ?qū)ｑRCA1區(qū)神經(jīng)

8、元放電的影響。結(jié)果如下：(1)在77個(gè)CA1區(qū)神經(jīng)元放電單位給予UⅡ(0.3，3.0，30.0，300.0nmol/L)2min，有63個(gè)放電單位(81.8％)放電頻率明顯降低，且呈劑量依賴(lài)性；(2)預(yù)先用100μmol/L的GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿灌流7個(gè)海馬腦片，6個(gè)放電單位放電頻率明顯增加，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，放電頻率無(wú)明顯變化；(3)預(yù)先用氯通道阻斷劑印防己毒素灌流8個(gè)海馬腦片，8個(gè)放

9、電單位頻率明顯增加，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，其放電頻率無(wú)變化；(4)16個(gè)放電單位灌流一氧化氮合酶抑制劑L-NAME50μmol/L，有14個(gè)單位(87.5％)放電明顯增加，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，放電仍被抑制。因此尾加壓素Ⅱ能抑制海馬神經(jīng)元自發(fā)放電，可能通過(guò)作用于GABAA受體而加強(qiáng)氯電流有關(guān)。 3尾加壓素Ⅱ?qū)Υ笫笙虑鹉X室旁核神經(jīng)元放電的影響應(yīng)用細(xì)胞外記錄單位

10、放電技術(shù)，在大鼠下丘腦腦片上觀察了UⅡ?qū)ο虑鹉X室旁核(paraventricularnucleus，PVN)神經(jīng)元放電的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：(1)在39個(gè)PVN神經(jīng)元放電單位給予尾加壓素Ⅱ(0.3，3.0，30.0，300.0nmol/L，n=39)2min，有32個(gè)放電單位(82.05％)放電頻率明顯降低，且呈劑量依賴(lài)性；(2)預(yù)先用100μmol/L的GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿灌流7個(gè)下丘腦腦片，5個(gè)放電單位放電頻率明顯增加，在

11、此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，放電頻率無(wú)明顯變化；(3)預(yù)先用氯通道阻斷劑印防己毒素(picrotoxin)灌流12個(gè)下丘腦腦片，其放電頻率明顯增加，表現(xiàn)為癲癇樣放電，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，11/12(91.67％)放電頻率無(wú)變化；(4)12個(gè)放電單位灌流一氧化氮合酶抑制劑(NG-nitro-L-argininemethylester，L-NAME)50mol/L，有11個(gè)單

12、位11/12(91.67％)放電明顯增加，在此基礎(chǔ)上灌流尾加壓素Ⅱ(30.0nmol/L)2min，放電被抑制。以上結(jié)果提示：尾加壓素Ⅱ能抑制下丘腦室旁核神經(jīng)元自發(fā)放電，可能與其與GABAA受體結(jié)合加強(qiáng)氯電流有關(guān)。 4尾加壓素Ⅱ?qū)ε囵B(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響本研究旨在觀察UⅡ?qū)ε囵B(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度[Ca2+]i的影響。經(jīng)熒光探針Flou3-AM標(biāo)記原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元，用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)神經(jīng)元

13、內(nèi)[Ca2+]i的熒光強(qiáng)度(fluoresenceintensity,H)，結(jié)果以FI或相對(duì)熒光強(qiáng)度(F1/F0％)表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，(1)在正常腦脊液(含鈣1.0mml/L)中，UⅡ3.0，30.0，300.0nmol/L濃度依賴(lài)性、時(shí)間依賴(lài)性地升高細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，分別升高195.19％(P＜0.001)，218.81％(P＜0.001)，249.29％。(2)在無(wú)鈣腦脊液中加入U(xiǎn)Ⅱ(30.0nmol/L)后[Ca2+]i有輕微升高(

14、P＜0.05)，但此升高的程度與UⅡ(30.0nmol/L)在正常腦脊液中所引起的鈣升高有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)；(3)在無(wú)鈣的腦脊液(正常腦脊液含3×10-3mmol/LEGTA)中，應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)三磷酸肌醇(IP3)受體阻斷劑肝素，UⅡ?qū)ι窠?jīng)元內(nèi)鈣濃度無(wú)影響(P＞0.05)；(4)UⅡ升高細(xì)胞內(nèi)鈣的效應(yīng)可以明顯被其受體阻斷劑BIM-23127阻斷。以上結(jié)果提示，UⅡ可以升高海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度，主要與其促進(jìn)細(xì)胞外鈣內(nèi)流

15、有關(guān)，且此效應(yīng)主要由神經(jīng)元細(xì)胞膜上UⅡ受體所介導(dǎo)。 5側(cè)腦室注射尾加壓素Ⅱ?qū)Υ笫笮难芟嚓P(guān)核團(tuán)中c-fos表達(dá)的影響利用Fos蛋白免疫組化方法，研究側(cè)腦室注射UⅡ(5μg)，對(duì)大鼠心血管相關(guān)核團(tuán)中c-fos的表達(dá)的影響。側(cè)腦室注射UⅡ誘發(fā)腦干的最后區(qū)，孤束核、下丘腦的室旁核、和中腦的腹側(cè)中央灰質(zhì)等多個(gè)部位的心血管中樞出現(xiàn)大量Fos蛋白樣免疫反應(yīng)神經(jīng)元(Fos-LI)，UⅡ受體阻斷劑BIM-23127(10μg)可明顯減弱此效應(yīng)。

16、以上結(jié)果表明，UⅡ可興奮腦內(nèi)部分心血管相關(guān)核團(tuán)的神經(jīng)元，UⅡ受體介導(dǎo)這一效應(yīng)。 結(jié)論1尾加壓素Ⅱ可以抑制頸動(dòng)脈竇壓力感受反射，此作用是UⅡ與平滑肌細(xì)胞膜上UⅡ的受體結(jié)合，通過(guò)開(kāi)放L型鈣通道引起頸動(dòng)脈竇區(qū)血管收縮而是實(shí)現(xiàn)的，與血管內(nèi)皮釋放的NO無(wú)關(guān)。 2尾加壓素Ⅱ能抑制海馬神經(jīng)元自發(fā)放電，可能與其與GABAA受體而加強(qiáng)氯電流有關(guān)。 3尾加壓素Ⅱ能抑制下丘腦室旁核神經(jīng)元自發(fā)放電，可能與其與GABAA受體結(jié)合加強(qiáng)氯電流