去甲腎上腺素對(duì)耳蝸螺旋神經(jīng)元GABA電流的作用.pdf

1、目的： 作為聽覺傳導(dǎo)通路的第一級(jí)神經(jīng)元，螺旋神經(jīng)元（spiral ganglion neuron）接受來自腦干聽覺核團(tuán)——橄欖耳蝸核的外側(cè)橄欖耳蝸傳出系統(tǒng)神經(jīng)纖維的支配和調(diào)控（GABA是其主要神經(jīng)遞質(zhì)），同時(shí)接受來自頸交感神經(jīng)節(jié)（頸上神經(jīng)節(jié)和星狀神經(jīng)節(jié)）的纖維支配（Noradrenaline是其主要神經(jīng)遞質(zhì)），但來自交感系統(tǒng)的纖維對(duì)耳蝸SGN 電活動(dòng)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本課題主要研究交感纖維神經(jīng)遞質(zhì)Noradrenaline對(duì)G

2、ABA在SGN誘發(fā)電流的影響及其胞內(nèi)機(jī)制，以探討交感系統(tǒng)調(diào)控SGN電活動(dòng)進(jìn)而調(diào)控聽覺的可能機(jī)制。 方法： 1、體外培養(yǎng)SGN 細(xì)胞并進(jìn)行形態(tài)和生理特性鑒定 對(duì)出生后0～5d的SD大鼠的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞進(jìn)行酶解分離與培養(yǎng)。用熒光倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)SGN 細(xì)胞的活力以及生長(zhǎng)與分化過程。應(yīng)用免疫熒光染色方法對(duì)SGN進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。建立穿孔膜片鉗記錄SGN電生理的技術(shù)方法并記錄SGN基本電生理特性。

3、 2、NA對(duì)GABA誘發(fā)SGN電流的作用 利用穿孔膜片鉗技術(shù)，觀察去甲腎上腺素（Noradrenaline, NA）對(duì)培養(yǎng)SGN GABA誘發(fā)電流的作用，以及介導(dǎo)NA調(diào)控SGN GABA電流的腎上腺素受體和NA 調(diào)控SGN GABA 電流的胞內(nèi)分子機(jī)制。 結(jié)果： 1、新生SD大鼠SGN在酶解分離、體外培養(yǎng)條件下，可獲得良好的細(xì)胞形態(tài)及表形分化，表現(xiàn)出穩(wěn)定的神經(jīng)元可塑性。本培養(yǎng)條件下細(xì)胞可存活7～10d。接種6h

4、后，部分細(xì)胞貼壁，有少部分細(xì)胞可見小突起，培養(yǎng)12 h 后貼壁完成并過渡為極性細(xì)胞，l8h后貼壁的SGN細(xì)胞多呈橢圓形，胞膜清晰、胞漿勻質(zhì)、折光性好，胞體透明，周圍有明顯的光暈。24h后，大多數(shù)SGN呈雙極神經(jīng)元形態(tài)，胞體兩極伸出神經(jīng)元突起，長(zhǎng)的達(dá)胞體的4～5倍，短的達(dá)胞體的2～4倍。SGN可以直接貼附于多聚賴氨酸基質(zhì)表面生長(zhǎng), 亦可附著在成纖維細(xì)胞形成的單層細(xì)胞“毯”的表面生長(zhǎng)。48～72h后細(xì)胞進(jìn)一步分化，神經(jīng)細(xì)胞突起可為胞體的7～

5、8倍。7d后細(xì)胞逐漸退變直至凋亡。除神經(jīng)細(xì)胞外，膠質(zhì)細(xì)胞、雪旺細(xì)胞多呈扁平、多角形或長(zhǎng)梭形，比神經(jīng)細(xì)胞胞體大，胞膜不清晰，無光暈。NeuN免疫細(xì)胞化學(xué)染色，SGN全細(xì)胞著色，呈綠色，橢圓形胞體和神經(jīng)突起十分清晰，表明具有神經(jīng)元的特征。 2、NA可逆性抑制GABA在培養(yǎng)SGN細(xì)胞上誘發(fā)的電流反應(yīng)，這種抑制作用具有濃度依賴型，且不影響GABA的反轉(zhuǎn)電位和GABA與其受體的親和力。Α1腎上腺素受體拮抗劑哌唑嗪（Pra），能輕微阻斷N

6、A對(duì)IGABA的抑制效應(yīng), α2腎上腺素受體激動(dòng)劑可樂定（Clo）和拮抗劑育亨賓(Yoh)能分別模擬和阻斷NA對(duì)GABA的作用。而β腎上腺素受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素（Iso）, 不能模擬NA對(duì)IGABA的抑制效應(yīng)。百日咳毒素（IAP）敏感的G蛋白參與了NA對(duì)SGN IGABA抑制性調(diào)控。NA對(duì)SGN IGABA的抑制作用是由蛋白激酶A（PKA）相關(guān)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制介導(dǎo)的，蛋白激酶A抑制劑H-89能模擬NA對(duì)GABA的作用，在加入cAMP

7、和蛋白激酶A激動(dòng)劑時(shí)NA對(duì)IGABA的作用消失，但是在加入蛋白激酶C的激動(dòng)劑PMA和抑制劑白屈菜赤堿（Che）時(shí)的，NA仍可抑制SGN IGABA。 結(jié)論： 1、培養(yǎng)新生大鼠SGN細(xì)胞的方法可獲得良好狀態(tài)的SGN細(xì)胞，SGN存活細(xì)胞的數(shù)量和周期可以滿足體外穿孔膜片鉗電生理實(shí)驗(yàn)的需要。 2、穿孔膜片鉗電生理結(jié)果表明NA對(duì)SGN細(xì)胞GABA電流的抑制作用是由α2腎上腺素受體介導(dǎo)的，α2腎上腺素受體激活后可通過抑制