轉(zhuǎn)錄因子Phox2對(duì)去甲腎上腺素能神經(jīng)元表型的調(diào)控研究.pdf

1、近年來(lái)，病毒載體已經(jīng)成功地用于介導(dǎo)基因或小分子干擾RNA進(jìn)入哺乳動(dòng)物神經(jīng)元或腦。然而，這個(gè)途徑的缺點(diǎn)是病毒載體的表達(dá)會(huì)隨時(shí)間而消退，表達(dá)的高峰出現(xiàn)在2-3天，7天后就消失了。如何將基因高效轉(zhuǎn)染及長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)成為人們研究的熱點(diǎn)。近期研究者把目光投向了以I型人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficieney virus type1，HIVl)為代表的慢病毒，不僅具有可感染非分裂期的細(xì)胞、目的基因整合至靶細(xì)胞基因組以及長(zhǎng)期表達(dá)、免疫反

2、應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，而且對(duì)重組包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒及重組目的基因穿梭質(zhì)粒進(jìn)行改造后，極大降低了其自我復(fù)制能力，使安全性大大提高，有望成為理想的基因載體。本研究采用RT-PCR方法獲得大鼠Phox2a和Phox2b全外顯子片段，將其克隆入慢病毒表達(dá)載體并進(jìn)行序列測(cè)定，利用293FT包裝細(xì)胞制備了Phox2a/2b與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)融合基因慢病毒。注射病毒濃縮液至大鼠

3、LC部位，介導(dǎo)Phox2a和Phox2b在LC長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，為研究Phox2a和Phox2b在去甲腎上腺素能系統(tǒng)中的作用及機(jī)制提供適合的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體，為基因治療一些神經(jīng)退化性疾病提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)分兩部分：一、用攜帶人類(lèi)Phox2a/2b cDNA的pCMV6-XL5載體以及對(duì)人類(lèi)Phox2a/2b基因特異的shRNA分別轉(zhuǎn)染SK-N-BE(2)C細(xì)胞，從過(guò)表達(dá)、封閉基因表達(dá)兩方面探索Phox2基因?qū)Ψ只?/p>

4、熟的去甲腎上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞中NET和DBH表達(dá)的影響。二、克隆大鼠Phox2基因并構(gòu)建能穩(wěn)定表達(dá)Phox2的慢病毒載體，通過(guò)慢病毒包裝體系生成能有效感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞的重組慢病毒顆粒；注射此重組慢病毒至大鼠LC部位，一段時(shí)間后觀察Phox2基因的過(guò)表達(dá)對(duì)成年大鼠腦組織相關(guān)部位NET和DBH表達(dá)的影響。本研究首次探索轉(zhuǎn)錄因子（包括Phox2a/2b）和成熟的去甲腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)之間可能的關(guān)系，為深入了解帕金森氏病(Parkins

5、on's disease，PD)、老年癡呆癥(Alzheimer's disease，AD)及重癥抑郁(Major depression)等神經(jīng)性疾病的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)；構(gòu)建的高效持久的攜帶Phox2基因的慢病毒表達(dá)載體為這些神經(jīng)性疾病的臨床治療提供新的途徑。
　　 第一部分轉(zhuǎn)錄因子phox2對(duì)SK-N-BE(2)C細(xì)胞中去甲腎上腺素傳遞體(NET)和多巴胺β-羥化酶(DBH)表達(dá)的影響
　　 目的：P

6、hox2a和Phox2b是兩個(gè)同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白，在胚胎形成過(guò)程中控制去甲腎上腺素能神經(jīng)元的分化。NET和DBH是去甲腎上腺素能系統(tǒng)的兩個(gè)重要標(biāo)志物。本研究檢測(cè)了Phox2a/2b在體外對(duì)NET和DBH表達(dá)的影響，從而了解Phox2基因?qū)Ψ只娜ゼ啄I上腺素能神經(jīng)元細(xì)胞的調(diào)控作用。
　　 方法：1．培養(yǎng)SK-N-BE(2)C細(xì)胞至90％匯合度時(shí)，分別用0.1、1、5μg攜帶人類(lèi)Phox2a/2b cDNAs的pCMV6-XL5質(zhì)粒

7、，由脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)照組則轉(zhuǎn)染pCMV6-XL5空載體。轉(zhuǎn)染后3～44天收集各組細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)Phox2a或Phox2b、NET、DBH、TH等在mRNA水平的表達(dá)；Western Blot檢測(cè)各指標(biāo)在蛋白水平的表達(dá)；NET的轉(zhuǎn)運(yùn)功能以再攝取[3H]標(biāo)記的去甲腎上腺素能力來(lái)判斷。2．SK-N-BE(2)C細(xì)胞培養(yǎng)至50-60％匯合度時(shí)，用Arrest-In轉(zhuǎn)染試劑將2μg對(duì)Phox2a或

8、Phox2b特異的shRNA質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對(duì)照組按相同步驟轉(zhuǎn)染pLK0.1空載體。轉(zhuǎn)染5-7天后收集各組細(xì)胞，按與l相同的方法檢測(cè)各指標(biāo)。3．為證明Phox2a或Phox2b是否單獨(dú)地調(diào)控甲腎上腺素能表型，將2μg對(duì)Phox2a(或Phox2b)特異的shRNA質(zhì)粒與5μgPhox2b(或Phox2a)cDNA同時(shí)轉(zhuǎn)染SK-N-BE(2)C細(xì)胞，對(duì)照組則同時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV6-XL5和pLK0.1空載體，3-4天后收集各組細(xì)胞測(cè)定DB

9、H在mRNA、蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：0.1～5μg的Phox2a/2b cDNAs能明顯提高NET和DBH在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，且呈劑量相關(guān)性。轉(zhuǎn)染后NET表達(dá)的增加相應(yīng)地表現(xiàn)出[3H]標(biāo)記的去甲腎上腺素?cái)z入的增加。和單獨(dú)轉(zhuǎn)染Phox2a或Phox2b相比，共轉(zhuǎn)染Phox2a和Phox2b并沒(méi)有表現(xiàn)出對(duì)NET和DBH表達(dá)的協(xié)同促進(jìn)作用。轉(zhuǎn)染對(duì)Phox2a或Phox2b基因特異的shRNA后，通過(guò)關(guān)閉內(nèi)源性P

10、hox2a/2b，顯著降低NET和DBH在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，同時(shí)伴隨著[3H]標(biāo)記的去甲腎上腺素?cái)z取的下降。而且，共轉(zhuǎn)染Phox2a和Phox2b基因特異的shRNAs后，其對(duì)NET的mRNA水平表達(dá)的影響具有累加效應(yīng)。最后，轉(zhuǎn)染Phox2a基因特異的shRNA所引起的DBH表達(dá)的下降可以通過(guò)轉(zhuǎn)染Phox2b基因的cDNA來(lái)逆轉(zhuǎn)，反之亦然。證明Phox2a和Phox2b對(duì)SK-N-BE(2)C細(xì)胞中DBH表達(dá)水平影響的互換效應(yīng)

11、。
　　 結(jié)論：該研究在體外證實(shí)了Phox2a和Phox2b對(duì)NET和DBH表達(dá)及生物學(xué)功能的調(diào)控作用，深入地闡明Phox2a/2b這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)去甲腎上腺素能系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)作用，可能開(kāi)辟了治療老年引起的去甲腎上腺素能系統(tǒng)功能失調(diào)的新途徑。
　　 第二部分?jǐn)y帶EGFP和大鼠phox2融合基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)大鼠腦去甲腎上腺素能神經(jīng)元的調(diào)控作用
　　 目的：克隆全長(zhǎng)大鼠轉(zhuǎn)錄因子Phox2 cDNA

12、，制備大鼠Phox2基因與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)融合基因慢病毒，病毒體外感染293FT細(xì)胞和體內(nèi)感染大鼠LC部位，以確定病毒攜帶的Phox2基因表達(dá)效率，探索Phox2基因的神經(jīng)生物學(xué)功能。
　　 方法：采用RT-PCR方法獲得大鼠Phox2a/2b全外顯子片段，運(yùn)用TOPO克隆技術(shù)使之克隆到慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pLenti6/V5-DEST中。經(jīng)限制性醇切、PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定重組載體。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將慢病毒包裝系統(tǒng)的包

13、裝結(jié)構(gòu)基因pCMV△8.9、包膜基因VSVG和目的基因pLenti6/V5-EGFP-Phox2a/2b導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞293FT，熒光顯微鏡檢測(cè)基因的表達(dá)。包裝成病毒后，收集病毒上清，濃縮。未濃縮的病毒液稀釋到不同濃度梯度轉(zhuǎn)染HT1080細(xì)胞，殺稻瘟素（Blasticidine）篩選抗性細(xì)胞克隆，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆后確定病毒滴度。制備的病毒感染293FT細(xì)胞，3天后熒光顯微鏡檢測(cè)基因的表達(dá)，收集細(xì)胞以Western Blot法檢測(cè)Phox2

14、基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。將大鼠分4組：對(duì)照組、假手術(shù)組、注射重組Phox2a病毒組和Phox2b組。濃縮的病毒(2～3μl，Ixlo8TU/ml)立體定位微量注射至大鼠LC部位，不同時(shí)間段(7d，14d，21d)取大鼠藍(lán)斑(LC)、海馬(hippocampus，HP)和嗅球(olfactory bulb，OB)等組織，通過(guò)原位雜交(In Situ Hybridization)、Western Blot、免疫組化(Immunohistoc

15、hemistry，IHC)、BrdU標(biāo)記等方法檢測(cè)各組Phox2、NET、DBH、TH及神經(jīng)元細(xì)胞增殖(Neurogenesis)等的變化。
　　 結(jié)果：限制性?xún)?nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序分析證實(shí)RT-PCR獲得的大鼠Phox2a/2b cDNA片段與GenBank中公布的數(shù)據(jù)基本吻合：EGFP與大鼠Phox2a/2b融合基因準(zhǔn)確克隆入pLenti6/V5-DEST的多克隆位點(diǎn)。慢病毒的3種質(zhì)?？筛咝мD(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞，熒光顯微鏡下

16、觀察可見(jiàn)大量的綠色熒光。未濃縮病毒液的滴度可達(dá)5xl06 TU/ml。病毒感染293FT細(xì)胞后Phox2基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)有明顯的增加。原位雜交結(jié)果顯示，注射重組Phox2a/2b病毒組在不同時(shí)間點(diǎn)，Phox2a和Phox2b在LC部位的mRNA水平均有顯著升高，注射后14天Phox2a增加最多，達(dá)146％;注射后7天Phox2b增加最多，達(dá)41％。與對(duì)照組及假手術(shù)組相比，Phox2a和Phox2b的過(guò)表達(dá)分別伴隨著NET和DBH

17、mRNA水平的明顯增加，NET分別增加了78.2％和110％，DBH分別增加了42.2％和39.3％；同樣，在HP部位，Western Blot結(jié)果顯示，和對(duì)照組及假手術(shù)組相比，Phox2a和Phox2b的過(guò)表達(dá)也分別伴隨著NET和DBH在蛋白質(zhì)水平的明顯增加，NET分別增加了78.4％和48.6％，DBH分別增加了37.6％和32.3％；在OB部位也獲得相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；BrdU標(biāo)記結(jié)果證明由Phox2a/2b導(dǎo)致的NET、DBH表達(dá)的

18、增加可以促進(jìn)LC部位神經(jīng)元細(xì)胞的增殖，尤其是聯(lián)合注射重組Phox2a和Phox2b病毒組對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞增殖的效應(yīng)最明顯。
　　 結(jié)論：成功制備了大鼠Phox2與EGFP融合基因慢病毒，為研究Phox2基因在去甲腎上腺素能系統(tǒng)的發(fā)生分化等過(guò)程中的作用機(jī)制提供合適的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的載體；體內(nèi)外試驗(yàn)證實(shí)上調(diào)Phox2的表達(dá)可促進(jìn)成熟大鼠腦組織中NET和DBH的表達(dá)，預(yù)示了Phox2基因?qū)S持大鼠出生后去甲腎上腺素能神經(jīng)元的功能發(fā)揮著重要作