去甲腎上腺素通過toll樣受體4促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌.pdf

1、應(yīng)激相關(guān)激素去甲腎上腺素(NE)對(duì)機(jī)體免疫功能的影響已受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。以往研究結(jié)果提示,NE能促進(jìn)或加劇內(nèi)毒素休克、過敏性疾病、慢性炎癥性疾病以及腫瘤等,但對(duì)其作用機(jī)制尚不很清楚。長(zhǎng)期反復(fù)應(yīng)激導(dǎo)致NE釋放從而致使機(jī)體炎癥和免疫功能發(fā)生改變,甚而影響到個(gè)體健康狀態(tài)的研究,對(duì)其進(jìn)行研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。 眾所周知,巨噬細(xì)胞廣泛分布于機(jī)體全身,被刺激后能釋放種類繁雜的細(xì)胞因子等物質(zhì),參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能。除分泌炎癥因子等

2、之外,巨噬細(xì)胞在某些刺激物如LPS等作用下會(huì)合成分泌相當(dāng)數(shù)量的神經(jīng)肽類物質(zhì)以及NE等。與此同時(shí),交感神經(jīng)末梢細(xì)密的分布在全身各個(gè)臟器,而且在那些存在相當(dāng)數(shù)量巨噬細(xì)胞的免疫器官中,也廣泛分布有交感神經(jīng)末梢。如淋巴結(jié)、脾臟和胸腺等免疫器官,交感神經(jīng)末梢極其豐富,甚至存在著類似于“突觸”樣的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而且在免疫系統(tǒng),巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等都有NE受體表達(dá),這些結(jié)構(gòu)可能為其在局部發(fā)揮作用提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),也提示交感神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)間相互

3、作用的緊密性和直接性。除下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸外,交感神經(jīng)系統(tǒng)是另一個(gè)重要的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)。在應(yīng)激時(shí)交感神經(jīng)末梢興奮,其釋放的NE是血液中NE的主要來(lái)源。無(wú)論是交感神經(jīng)釋放NE,還是自身受到LPS刺激后分泌NE,巨噬細(xì)胞很容易處身于一個(gè)富于NE的微環(huán)境。近年來(lái),模式識(shí)別受體TLR受到免疫學(xué)家的高度重視,被認(rèn)為是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁。有文獻(xiàn)報(bào)道,NE能夠調(diào)節(jié)心血管細(xì)胞的氧化應(yīng)激,而活性氧(ROS)參與調(diào)節(jié)toll樣受體4(TL

4、R4)表達(dá)。那么,NE能否調(diào)節(jié)TLR4呢?NE是否可能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激進(jìn)而調(diào)節(jié)TLR4?為此,我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)： (1)從整體水平,檢驗(yàn)NE是否能夠調(diào)節(jié)模式識(shí)別受體TLR4的表達(dá)。應(yīng)用束縛應(yīng)激模型,通過免疫組化觀察模型小鼠脾臟TLR4表達(dá)變化,并觀察束縛應(yīng)激小鼠LPS所致休克后72 h存活率。 (2)Western blot及Quantitative real time PCR技術(shù)檢測(cè)NE對(duì)體外巨噬細(xì)胞T

5、LR4表達(dá)的影響。 (3)Western blot檢驗(yàn)ROS是否能夠調(diào)節(jié)TLR4表達(dá)。觀察不同劑量的活性氧對(duì)TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,應(yīng)用細(xì)胞色素C還原法及活性氧熒光探針法檢測(cè)NE是否能夠影響巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)。 (4)NE或ROS處理過的巨噬細(xì)胞,ELISA檢測(cè)在LPS刺激下TNFα變化,化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)NO生成變化。 (5)探討NE調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的具體機(jī)制,Westem blot檢測(cè)NE可能是通過影響

6、PKC進(jìn)而影響NADPH氧化酶等。 主要結(jié)果如下： (1)免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激后的模型小鼠脾臟組織TLR4表達(dá)增高,與注射6-OHDA后束縛應(yīng)激小鼠相比,TLR4表達(dá)量也顯著增加。 (2)NE能夠促進(jìn)體外巨噬細(xì)胞TLR4表達(dá)。不同劑量的NE處理巨噬細(xì)胞12 h和24 h后,小鼠巨噬細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)量及mRNA轉(zhuǎn)錄顯著增加,β受體阻斷劑Propranolol及α受體阻斷劑Phtentolamine都能部

7、分阻斷其上述作用,還原劑N乙酰半胱氨酸能部分阻斷NE對(duì)TLR4表達(dá)的促進(jìn)作用。 (3)NE能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS,后者能夠調(diào)節(jié)TLR4。不同劑量的NE能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS,而且具有劑量依賴性。ROS調(diào)節(jié)TLR4表達(dá)具有雙向性。高劑量(>100μM)的H2O2抑制TLR4表達(dá),而較低劑量(10μM)則促進(jìn)TLR4表達(dá)。 (4)NE或者H2O2處理巨噬細(xì)胞24 h后,再用LPS刺激巨噬細(xì)胞后產(chǎn)生的TNFα和NO比L