反義Toll樣受體4表達質(zhì)粒對內(nèi)毒素刺激巨噬細胞的影響.pdf

1、復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文反義Toll樣受體4表達質(zhì)粒對內(nèi)毒素刺激巨噬細胞的影響姓名：曹中偉申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：張順財2002.5.1攆受體4 的特舅性g l 物，5 、末端各鑫醛帶上有關(guān)酶留經(jīng)點凈魏，上游葶} 物5 、術(shù)端蜷上E c o Rl 酶切搜點：G { A A T T C ，翼體癢列夯5 、一G A 文糟C C T G C G C T G C CA C C A G T T A C A G A - 3 ’；鏈于T

2、o l l 攆受體4 e D N A 黥1 3 9 ．1 6 1 b D 下游雩l 物5 、末端帶上K p nI 懿切位點：G G T A C { c 以及越始密瑪予A T G ，爨體序列為5 ’一G G T A C C A T G T T C C C T G A A A G G C 鞭G G T C 玎G A A ．3 ’， 經(jīng)予{ b l l 櫸受體4 e D N A 魄8 5 7 ，8 8 0 b p 。以小鼠巨噬緞臌株R A W

3、 2 6 4 + 7 撼提豹總R N A 饞為R T - P C R模板，擴增的T o l l 樣受體4 片段長度為7 5 7 b p ( 1 3 9 ．8 8 0 ) ?？P他壓周T 4 D N A 連接酶將T L R 4 產(chǎn)物連接到p G E M ．T 載體上，形成p G E M ．T o l l 橫受體4 矮粒，然磊轉(zhuǎn)染J M l 0 9 離效感受態(tài)細胞。在會甄芐毒霉索( 1 0 眩g ／m 1 ) 蛉營逶L B ( L u r i

4、 a - B e r t a n i ) 瓊脂平板上篩選質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的陽性寵隧。拶8 選2 0 個陽性克隆進行質(zhì)粒擴增和抽提，然后酶切和D N A 測序鑒定。保留D N A 測序結(jié)果與T o l l 櫸受體4 基因的部分序列憲全～致的細菌克隆。酶切p G E M —T o l l 樣受體4 以及載體p T r a c e r ．C M V 2 ，純化各彝的爨的片段。質(zhì)粒D N A 經(jīng)過不同的限制性內(nèi)切酶的酶切后通常形成不同的粘性切朋，根攢堿

5、摹配對原則，與其他內(nèi)切酶酶切廚D N A 切口序列結(jié)合具有一定的限制性，粘性末端相同的切口易于連接。在p T r a c e r - C M V 2 載體的巨細胞病海( c y t o m e g a l o r i v u s ，C M V ) 強啟動子韻下游序列中，K p n I 位于E c o R 1 的上游，而T o l l 樣受體4 c D N A的P C R 產(chǎn)物中K p n I 便于其e D N A 的F 游，而E c o

6、 R I 在其上游，所以通過D N A連接反應(yīng)能使p G E M —T o l l 樣受體4 的酶切純化產(chǎn)物反向連接到p T r a c e r ．C M V 2載體上，形成p T r a c e r —C M V 2 反義T o l l 樣受體4 質(zhì)粒。然后將反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到J M l 0 9 離效感受態(tài)細胞內(nèi)，在含z e o c i n ( 5 0 9 9 ／m 1 ) 的低鹽L B 瓊脂平板上篩選陽性殼隆。焉酶鐲和D N A 測序的

7、方法簽定p T r a c e r - C M V 2 反義T o l l 樣受體4 質(zhì)粒。二、愛爻T L R 4 表達質(zhì)粒與空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染R A W 2 6 4 ．7 細胞躦脂質(zhì)體D O S P E R 包埋p T r a c e r - C M V 2 反義T o l l 樣受體4 質(zhì)粒和p T r a c e r - C M V 2 空鑫對照表達麓粒( 6 1 ．t l D O S P E R ／I ．5 l _ t g D N A

8、 ) ，室溫下孵育1 5 分鐘居，轉(zhuǎn)染6i L 平板培養(yǎng)靜，j 、鬣莓噔綏穩(wěn)株R A W 2 6 4 ．7 內(nèi)。通過質(zhì)粒攜帶的z e o c i n耐楚基因爹藜選騮性纓濺，鰓膣培養(yǎng)液D M E M ( D M E M + I O ％駱牛血清) 中加入z e o c i n 戇選，濃度出低到贏，扶5 0 9 9 ／m l 蠢至1 0 0 0 l a g ／m l ，3 滴后篩選工作完成，以居細難壤募波長期維持終濃度勢t 0 0 l a g

9、 ／m lz e o c i n 培養(yǎng)繡稔。同時以熒光顯微鏡檢測質(zhì)城質(zhì)攜繁的綠色熒光爨皇( G r e e nF l u o r e s c e n tP r o t e i n ，G F P ) 報告基函( r e p o r t e O 的表達劌婭質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，以及浚聯(lián)粒能否在冀核綱葑篷中長期穩(wěn)定穗表達。三、反義小鼠T L R 4 襲達質(zhì)粒對內(nèi)毒索刺激葵巨噬纓腿豹影嘲在穩(wěn)定表達反義T o l l 樣受體4 質(zhì)坡鄆宅白對照p T r