粒細(xì)胞集落刺激因子對肝硬化大鼠腸細(xì)菌轉(zhuǎn)位及小腸Toll樣受體4表達(dá)的影響.pdf

1、背景和目的：肝硬化是臨床常見消化道疾病，并發(fā)癥有消化道出血、肝細(xì)胞肝癌、肝性腦病、肝腎綜合征和感染等，是目前嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一。肝硬化患者有自發(fā)性腹膜炎、菌血癥等嚴(yán)重感染的易感性。腸道來源的革蘭陰性需氧菌如大腸桿菌是肝硬化時細(xì)菌感染的主要致病菌。肝硬化者常有腸道細(xì)菌過度生長，進而造成腸道細(xì)菌轉(zhuǎn)位，是腸源性細(xì)菌感染的重要原因之一。而腸細(xì)菌過度生長和腸細(xì)菌轉(zhuǎn)位又可以通過內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)一系列的細(xì)胞因子產(chǎn)生，進一步加重肝臟的損害

2、。 Toll樣受體是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的免疫受體，它通過識別病原微生物及其細(xì)胞壁上脂多糖來啟動先天性免疫，并能通過信號傳導(dǎo)啟動獲得性免疫，在機體的免疫防御中起重要作用。目前哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)12個Toll受體，分布于各個器官臟器。通過信號傳導(dǎo)可促進細(xì)胞因子的合成和釋放；促進免疫細(xì)胞的成熟和分化，并表達(dá)相關(guān)的免疫分子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。Toll樣受體尚能識別自身組織和同種異體組織，引起器官臟器的免疫耐受，也能引起自身免疫功能紊亂，在維持機

3、體的正常功能和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展方面有重要作用。Toll樣受體特有的識別功能為臨床某些疾病的防治，如內(nèi)毒素休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征、腫瘤、變應(yīng)性疾病、宿主同種免疫排斥反應(yīng)等提供了新的途徑。 目前認(rèn)為Toll樣受體4(TLR4)為內(nèi)毒素細(xì)胞跨膜信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵性受體。內(nèi)毒素經(jīng)細(xì)菌釋放后，由脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)運輸至細(xì)胞膜表面，LPS 以LPS-LBP-CD14復(fù)合物形式與TLR4胞外段輔助蛋白 MD-2結(jié)合，引起TLR4胞

4、內(nèi)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化，促使一系列下游銜接蛋白募集至胞內(nèi)端的TIR結(jié)構(gòu)域。這些銜接蛋白包括MyD88、Tollip、TIRAP等。這些銜接蛋白繼而通過一系列下游分子引發(fā)酶學(xué)級聯(lián)反應(yīng)，并激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB、AP-1等轉(zhuǎn)錄目的基因。NF-kB和AP-1的活化均可導(dǎo)致炎癥因子如TNF-α、IL-1等的大量表達(dá)，形成炎癥。 粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是臨床常用免疫調(diào)節(jié)劑，在體內(nèi)作用廣泛，如誘導(dǎo)粒系干細(xì)胞分化、促使中性粒細(xì)胞成熟、激活中

5、性粒細(xì)胞并促使其分泌各種炎癥因子等。研究發(fā)現(xiàn)，粒細(xì)胞集落刺激因子在體外可促進TLR4mRNA表達(dá)，并通過TLR4細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，使得其效應(yīng)分子TNF-α分泌增加。G-CSF有可能通過促進體內(nèi) TLR4基因的表達(dá)，使得炎癥因子表達(dá)增加，從而促進內(nèi)毒素血癥清除，并達(dá)到免疫調(diào)節(jié)的目的。本研究目的是評價G-CSF對肝硬化大鼠腸細(xì)菌過度生長、細(xì)菌轉(zhuǎn)位的影響以及G-CSF對肝臟可能存在的保護作用；通過對TLR4在肝硬化大鼠腸道表達(dá)的研究，了解肝硬化

6、大鼠腸道TLR4表達(dá)與腸道細(xì)菌免疫的關(guān)系。 方法：采用用皮下注射四氯化碳橄欖油溶液聯(lián)合戊巴比妥飲水的方法誘導(dǎo)肝硬化大鼠模型。于第9周開始將模型大鼠分為兩組：干預(yù)組和模型組，其中干預(yù)組大鼠用G-CSF進行干預(yù)。第10周留取標(biāo)本。大鼠血清進行生化檢測。取小腸內(nèi)容物稀釋后接種于麥康凱瓊脂平板在微需氧環(huán)境、36.9℃溫箱里培養(yǎng)24-48h，進行菌落計數(shù)。取肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)組織少許制成勻漿后接種于麥康凱瓊脂平板在微需氧環(huán)境、36.9℃

7、溫箱里培養(yǎng)24-48h，進行陽性率計數(shù)，并進行細(xì)菌定性分類。肝臟病理HE染色和網(wǎng)染，進行肝臟炎癥分級、纖維化分期檢查。大鼠小腸組織進行TLR4免疫組織化學(xué)染色，計算陽性面積百分比。小腸組織總RNA抽提，調(diào)整總RNA濃度后進行逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增，電泳，與β-actin內(nèi)參進行條帶灰度比較。 結(jié)果：實驗大鼠共死亡6只，總死亡率15％。G-CSF干預(yù)組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平明顯低于模型組

8、和正常組。G-CSF干預(yù)組大鼠肝臟損害較模型組減輕(肝臟病理炎癥分級秩次8.46vs17.82；肝纖維化分期平均秩次7.79vs18.39)。G-CSF干預(yù)組腸細(xì)菌過度生長發(fā)生率(G-CSF干預(yù)組vs模型組：58.3％vs92.9％)和細(xì)菌轉(zhuǎn)位的發(fā)生率(G-CSF干預(yù)組vs模型組：33.3％vs57.1％)均低于模型組。小腸TLR4免疫組化染色三組均有表達(dá)，模型組陽性表達(dá)平均秩次高于干預(yù)組，干預(yù)組高于正常對照組。RT-PCR研究也有同樣

9、的發(fā)現(xiàn)。 結(jié)論： 1．肝硬化大鼠存在腸道細(xì)菌過度生長和細(xì)菌轉(zhuǎn)位。 2．肝臟損害的程度與腸道細(xì)菌過度生長和細(xì)菌轉(zhuǎn)位有相關(guān)性。 3．G-CSF可降低肝硬化大鼠腸細(xì)菌過度生長和細(xì)菌轉(zhuǎn)位的發(fā)生率，G-CSF干預(yù)組大鼠肝臟損害較模型組減輕。 4．TLR4在各組大鼠小腸粘膜均有表達(dá)。 5．大鼠腸道TLR4的表達(dá)增加與腸道細(xì)菌過度生長和細(xì)菌轉(zhuǎn)位有關(guān)，發(fā)生腸細(xì)菌過度生長和細(xì)菌轉(zhuǎn)位的大鼠腸道TLR4有較高的